肺炎支原體LAMPs經(jīng)PI3K/Nrf2誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表達(dá)HO-1

劉 艷，劉 丹，朱翠明

肺炎支原體LAMPs經(jīng)PI3K/Nrf2誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表達(dá)HO-1

劉 艷1，劉 丹2，朱翠明3

目的 探討肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane protein，LAMPs)對人單核細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的影響，并探討可能的調(diào)控機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，用不同濃度的LAMPs作用后，分別采用realtime-PCR和Western blot檢測HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)采用不同濃度的放線菌素D(ActD)和放線菌酮(CHX)預(yù)處理細(xì)胞，觀察其對HO-1表達(dá)的影響，以證實(shí)HO-1的表達(dá)是否通過轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；提取LAMPs作用前后的核蛋白，凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)檢測Nrf2的核轉(zhuǎn)位、Western blot檢測Akt的磷酸化情況；同時(shí)采用PI3K抑制劑LY294002處理細(xì)胞，觀察其對LAMPs誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1表達(dá)的影響；最后采用 siRNA干擾Nrf2表達(dá)，以證實(shí)Nrf2是否參與調(diào)控HO-1表達(dá)。結(jié)果 (1)0～5 μg/mL LAMPs能以劑量依賴性方式誘導(dǎo)THP-1表達(dá)HO-1 mRNA和蛋白；(2)5 μg/mL LAMPs能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞Akt磷酸化，并能增強(qiáng)其DNA結(jié)合活性；PI3K抑制劑LY294002處理后，可明顯抑制LAMPs誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)和Nrf2核轉(zhuǎn)位；(3)干擾Nrf2表達(dá)后，可明顯下調(diào)LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1。結(jié)論 LAMPs可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1，其機(jī)制可能與PI3K/Nrf2通路有關(guān)。

脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白；血紅素氧合酶-1；核因子相關(guān)因子-2

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是引起非典型肺炎最常見的病原體之一[1]。目前，對支原體的發(fā)病機(jī)制尚未明了。有研究顯示，支原體細(xì)胞膜上的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)是其誘發(fā)免疫反應(yīng)的主要物質(zhì)[2-3]。LAMPs刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子、活性氧類(ROS)、NO等炎癥產(chǎn)物[4]，一方面有利于免疫系統(tǒng)清除支原體，另一方面，過度炎癥可能造成機(jī)體的免疫損傷[5]。為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，必然存在多種炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控機(jī)制，能在炎癥發(fā)生的各個(gè)階段調(diào)控其反應(yīng)的程度和強(qiáng)度，最終維持機(jī)體的免疫平衡。研究發(fā)現(xiàn)， 機(jī)體在感染狀態(tài)下可合成多種保護(hù)性蛋白，包括血紅素氧化酶-1(Heme oxygenase 1，HO-1)和還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶(NADPH：quinine oxidoreductase，NQO1)等。前期研究中，本研究所馬小華等發(fā)現(xiàn)了支原體脂肽MALP-2可通過激活Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[6]。但由于MALP-2為人工合成脂肽，無法全面反應(yīng)支原體感染的實(shí)際情況。本研究旨在觀察LAMPs誘導(dǎo)人單核細(xì)胞表達(dá)HO-1的情況，并探討其可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 Mp標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 29342)由南華大學(xué)病原生物研究所保存；人單核細(xì)胞系THP-1購自中國典型培養(yǎng)物保存中心。Trizol試劑購自大連寶生物生工生物公司，BCA 蛋白測定試劑盒及ECL發(fā)光液體購自Pierce，LDH分析試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，LY294002購自Sigma-Adrich，Lipofectamine 2000購自Invitrogen，Nrf2、HO-1 siRNA購自廣州Ribio公司，抗HO-1、抗β-actin和TBP多克隆抗體購自Santa Cruz，抗Nrf2、抗磷酸化Akt和Total Akt抗體購自Cell Signaling。

1.2 方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)與預(yù)處理 將冷凍保存的THP-1細(xì)胞復(fù)蘇并進(jìn)行傳代，選擇處于指數(shù)生長期、且狀態(tài)好的細(xì)胞分4組分別進(jìn)行預(yù)處理。第1 組：將1×106/mL的THP-1細(xì)胞在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h；第2組：分別用不同濃度的放線菌素D(ActD，轉(zhuǎn)錄抑制劑)和放線菌酮(CHX，翻譯水平抑制劑)預(yù)處理THP-1細(xì)胞1 h；第3組：用不同濃度的PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理THP-1細(xì)胞30 min；第4組：對THP-1細(xì)胞不做任何預(yù)處理。

1.2.2 LAMPs的提取 將M129標(biāo)準(zhǔn)株菌液接種于PPLO肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫孵育，5～7 d后，待培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)橥噶恋某赛S色后轉(zhuǎn)接進(jìn)行增量培養(yǎng)，收菌。LAMPs的提取按照相關(guān)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[7]。

1.2.3 LAMPs最大作用濃度的選擇 THP-1細(xì)胞經(jīng)LAMPs作用前，首先采用LDH漏出實(shí)驗(yàn)確定其最大作用濃度。 將約105個(gè)THP-1細(xì)胞接種到96孔板中，加入不同濃度的LAMPs孵育24 h，通過檢測各孔OD值/空白對照孔OD值以判斷培養(yǎng)液中LDH的釋放水平。

1.2.4 Western Blot檢測 HO-1蛋白表達(dá)和Akt磷酸化 用不同濃度的LAMPs作用于第1組預(yù)處理THP-1細(xì)胞16 h，觀察不同濃度LAMPs對HO-1蛋白表達(dá)的影響；用最大濃度LAMPs作用于第2組預(yù)處理的THP-1細(xì)胞16 h，觀察放線菌素D和放線菌酮對THP-1細(xì)胞HO-1表達(dá)的影響；用最大濃度LAMPs作用于第3組預(yù)處理的THP-1細(xì)胞16 h，同時(shí)用最大作用濃度LAMPs作用第4組THP-1細(xì)胞0～60 min后，收集不同時(shí)間細(xì)胞總蛋白，用Akt磷酸化抗體和總抗體行Western blot，觀察LAMPs對THP-1細(xì)胞Akt磷酸化的影響。

1.2.5 RT-PCR檢測HO-1mRNA的表達(dá)水平 用不同濃度LAMPs作用THP-1細(xì)胞16 h和用最大作用濃度LAMPs作用THP-1細(xì)胞0～24 h，隨后采用TRIzol法提取處理后THP-1細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR檢測HO-1mRNA的表達(dá)水平，觀察LAMPs對THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1 mRNA在不同的作用濃度和不同的作用時(shí)間上的影響。

1.2.6 凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)檢測 Nrf2 DNA 結(jié)合活性 對THP-1 細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，按照試劑盒提供的方法獲取核蛋白、建立反應(yīng)體系， 然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移后，交聯(lián)固定 DNA， 化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.7 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將THP-1細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中。按lipofectamine 2000提供的操作步驟，將100 nmol/L Nrf2 siRNA(正義鏈 5′-UCCCGUUUGUAGAUGACAA-3′；反義鏈 5′-UUGUCAUCUACAAACGGGA-3′)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染4h后再換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，30 h后，再用5.0 μg/mL LAMPs刺激THP-1細(xì)胞16 h，提取總蛋白，Western blot檢測HO-1表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 確定LAMPs的最大作用濃度 THP-1細(xì)胞經(jīng)LAMPs作用前，首先采用LDH漏出實(shí)驗(yàn)確定其最大作用濃度。如圖1所示，0.5～5 μg/mL LAMPs作用于THP-1細(xì)胞后，與對照組相比，LDH含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而LAMPs濃度增加至10 μg/mL時(shí)，LDH含量明顯增高。因此在隨后研究當(dāng)中，LAMPs采用最大濃度5 μg/mL作為刺激濃度。

2.2 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞HO-1 mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，陰性對照組HO-1 mRNA表達(dá)水平極低，隨著LAMPs濃度的增加，HO-1 mRNA含量逐漸增多(圖2A)。此外，HO-1 mRNA水平在不同的時(shí)間點(diǎn)也有所不同，其中LAMPs作用8 h后達(dá)到峰值，隨后逐漸下降(圖2B)。

Fig.1 Effect of the release of LDH by different concentration of LAMPs

2.3 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1 蛋白 Western blot顯示，不同濃度LAMPs作用THP-1細(xì)胞16 h后，可明顯誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)，其含量與LAMPs的濃度呈一定的劑量依賴性(圖3)。

Fig.3 Impact on the expression of HO-1 protein by different concentration of LAMPs

2.4 LAMPs經(jīng)持續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯誘導(dǎo)HO-1表達(dá) THP-1細(xì)胞經(jīng)不同濃度的放線菌素(ActD，轉(zhuǎn)錄抑制劑)和放線菌酮(CHX，翻譯水平抑制劑)作用后，可顯著抑制LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1(圖4A、B)。

2.5 LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)與PI3K有關(guān) LAMPs作用15min后Akt磷酸化到達(dá)高峰，隨后隨之降低。而總Akt在所有處理組中保持恒定(圖5A)。此外，采用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理THP-1細(xì)胞后，可顯著降低LAMPs誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)(圖5B)。

2.6 LAMPs增強(qiáng)THP-1細(xì)胞Nrf2 DNA結(jié)合活性 LAMPs處理30 min尚不能檢測出Nrf2 DNA結(jié)合活性的變化，60 min后開始增強(qiáng)，120 min后達(dá)到高峰。未標(biāo)記Nrf2探針可使DNA-蛋白結(jié)合形成的滯后條帶消失，而NF-κB探針對其無明顯影響。此外，采用PI3K抑制劑LY294002處理后，Nrf2 DNA結(jié)合活性顯著降低。見圖6。

2.7 干擾Nrf2表達(dá)抑制LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1 采用siRNA干擾Nrf2表達(dá)后，再用LAMPs刺激THP-1細(xì)胞16 h，Western blot結(jié)果顯示，HO-1的表達(dá)顯著降低(圖7)。

Fig.6 LAMPs could raise the DNA-binding activity of Nrf2 via PI3K pathways

3 討 論

機(jī)體感染支原體后，單核巨噬細(xì)胞通過其表面的TLR識(shí)別，并經(jīng)MyD88/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)合成和分泌一系列炎癥因子和介質(zhì)。對于機(jī)體而言，這些炎癥因子的合成和分泌受到嚴(yán)格的調(diào)控，從而使機(jī)體的炎癥-抗炎反應(yīng)趨于平衡而避免過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。目前已經(jīng)證實(shí)，機(jī)體可表達(dá)過多抗氧化、抗炎癥功能的蛋白以負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)，其中以HO-1研究最為透徹[8]。研究顯示，通過誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可顯著降低細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的含量，抑制粘蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡[9]。這表明HO-1在維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，這可能是機(jī)體一種獲得性的自我保護(hù)機(jī)制。研究顯示，細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激THP-1細(xì)胞后，可誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)HO-1和NQO1，從而抑制炎癥因子的過度分泌[10]。馬小華的研究結(jié)果也顯示人工合成的MALP-2可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)HO-1[6]。

由于支原體的致炎物質(zhì)主要是LAMPs，因此被本研究選用。在觀察LAMPs對HO-1的誘生作用時(shí)，首先必須排除LAMPs對THP-1細(xì)胞的非特異性損傷以避免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究通過測定LDH的方法發(fā)現(xiàn)LAMPs的最大作用濃度為5 μg/mL。

本研究還發(fā)現(xiàn)，LAMPs作用THP-1細(xì)胞4 h后即可誘導(dǎo)HO-1 mRNA表達(dá)，8 h后達(dá)到高峰。通過采用轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制劑處理后證實(shí)HO-1的表達(dá)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。有研究對LPS處理THP-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，刺激后8 h內(nèi)檢測不到HO-1的表達(dá)，這與本研究結(jié)果不太一致。這可能與LPS和LAMPs具有不同的受體有關(guān)，因?yàn)長PS主要是通過TLR4和CD14所識(shí)別，而LAMPs則通過TLR2/6，隨后所激活的信號(hào)通路有所不同所致[11]。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，人體單核/巨噬細(xì)胞中PI3K主要由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成。當(dāng)PI3K激活后，可將底物PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3。PIP3作為第二信使，最終激活A(yù)kt(即，蛋白激酶B)[12]。因此，檢測細(xì)胞中Akt的磷酸化水平可以間接反應(yīng)PI3K的活性。本研究發(fā)現(xiàn)LAMPs處理THP-1細(xì)胞后5 min即可檢測出Akt磷酸化，15 min后到達(dá)高峰，這表明LAMPs可激活PI3K。為了進(jìn)一步明確PI3K是否參與HO-1的表達(dá)，本研究隨后采用PI3K抑制劑LY294002處理THP-1細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HO-1表達(dá)顯著降低。這表明HO-1的表達(dá)可能受PI3K的調(diào)控。

Nrf2是參與調(diào)控的主要核轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞靜息狀態(tài)下，Nrf2在胞漿內(nèi)與其抑制因子Keap1結(jié)合而呈非激活狀態(tài)。氧化應(yīng)激、親電子物質(zhì)等可使Nrf2從 Keap1中解離并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)與相關(guān)基因啟動(dòng)子上的抗氧化反應(yīng)元件位點(diǎn)結(jié)合，從而誘導(dǎo)抗氧化作用的基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其抗氧化或抗炎癥作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)LAMPs可上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的DNA結(jié)合活性量，這表明LAMPs可激活Nrf2。同時(shí)，通過采用PI3K抑制劑處理后，結(jié)果顯示Nrf2的DNA結(jié)合活性明顯降低。以上結(jié)果表明LAMPs可激活PI3K/Nrf2通路。

HO-1啟動(dòng)子上含有Nrf2的調(diào)控位點(diǎn)。為了觀察Nrf2是否參與調(diào)控HO-1的表達(dá)，本研究采用Nrf2特異性siRNA干擾其表達(dá)后[14]，結(jié)果顯示，LAMPs誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)顯著降低。這表明LAMPs誘導(dǎo)HO-1表達(dá)是通過PI3K/Nrf2通路而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述， LAMPs可激活THP-1細(xì)胞中PI3K/Nrf2信號(hào)通路，并誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。但LAMPs與TLR結(jié)合后，能否激活其他激酶和信號(hào)通路，包括MAPKs，NADPH氧化酶等，以及LAMPs誘生的HO-1能否負(fù)調(diào)控支原體感染后的炎癥反應(yīng),尚有待于進(jìn)一步研究。

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Mycoplasma pneumoniae lipid-associated membrane proteins inducing Heme oxygenase-1 expression via PI3K/Nrf2 in THP-1 cell

LIU Yan1,LIU Dan2,ZHU Cui-ming3

(1.Department of Medical Laboratory, Shaoyang Medical College, Shaoyang 422000, China;2.Shaoyang Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shaoyang 422000, China;3.Institute of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

The aim of this study is to investigate the mechanisms ofMycoplasmapneumonia-derived lipid-associated membrane proteins (LAMPs) inducing heme oxygenase-1 expression in human mononuclear cell line THP-1 cells. THP-1 cells were culturedinvitro, and treated by different concentration of LAMPs; the mRNA and protein level of HO-1 were detected by real time-PCR and western blot, respectively. Meanwhile, actinomycin D and cycloheximide were administered to pretreat THP-1 cell, subsequently challenged by 5.0 μg/mL LAMPs for 16 hrs, and the expression of HO-1 was detected by western blot. To determine the phosphorylation of Akt and the DNA-binding activity of Nrf2, western blot and electrophoretic mobility shift assay were used to detect the nucleoprotein and cytoplasm protein extracted from the THP-1 cell administered by LAMPs. The PI3K inhibitor LY294002 was also administered to investigate the effects of LAMPs on the activity of Nrf2. At last, siRNA was used to confirm the involvement of Nrf2 in regulation of HO-1 expression. Results showed that (Ⅰ) 0-5 μg/mL LAMPs induced HO-1 mRNA and protein dose-dependent expression in THP-1 cells; (Ⅱ)5 μg/mL LAMPs could induce Akt phosphorylation in THP-1 cells, and raise the DNA-binding activity of Nrf2, and PI3K inhibitor LY294002 could significantly inhibit its activity; (Ⅲ) Silencing of Nrf2 by siRNA could downregulate LAMPs induced HO-1 expression in THP-1 cell. In conclusion, LAMPs could induce HO-1 expression in THP-1 cell via PI3K/Nrf2 pathways.

lipid-associated membrane protein; heme oxygenase-1; nuclear factor related factor-2

Liu Dan, Email: 49467274@qq.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.012

劉丹，Email：49467274@qq.com

1.邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，邵陽 422000； 2.湖南省邵陽市疾病預(yù)防控制中心，邵陽 422000； 3.南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽 421001

R375

A

1002-2694(2015)04-0348-05

2014-07-10；

2014-10-29

湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(14B164)

Supported by the Excellent Young Project of Education Department of Hunan Province (No. 14B164)