布魯氏菌基因組學(xué)研究進展

劉志國，王 妙，崔步云，劉日宏，夏咸柱

布魯氏菌基因組學(xué)研究進展

劉志國1,2,3，王 妙3，崔步云4，劉日宏3，夏咸柱5

布魯氏菌是一類革蘭氏陰性、胞內(nèi)寄生菌，缺乏經(jīng)典的毒力因子，致病性不僅依靠侵襲力和內(nèi)毒素，還有賴于較強的環(huán)境適應(yīng)能力。目前，布魯氏菌入侵機體和在胞內(nèi)持續(xù)存在的機制尚未明確。布魯氏菌基因組學(xué)研究不僅可全面了解布魯氏菌的基因組成、分子進化、毒力因子以及致病機制等特點，還可以對一些致病相關(guān)基因和重要的蛋白進行預(yù)測。該研究為開發(fā)研究疫苗和新型抗生素提供分子基礎(chǔ)，從而為構(gòu)建新的有效的布病治療和防控策略提供理論依據(jù)。本文就布魯氏菌的基因組組成、特征，全基因組測序分析、比較基因組研究進展予以概述。

布魯氏菌；基因組；比較基因組學(xué)；進化基因組學(xué)

布魯氏菌是一類重要的人獸共患病病原菌，不僅對人和多種動物致病，亦是一種潛在的生物武器[1]。目前，布魯氏菌的致病機制、毒力基因以及在胞內(nèi)持續(xù)存在的機制尚不完全明確，致使安全有效疫苗和藥物的研發(fā)處于停滯。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，已有許多布魯氏菌被測序分析，通過測序分析發(fā)現(xiàn)，不僅同一個種內(nèi)部不同菌株之間基因組有較大的差異,有SNP缺失和插入，還有基因數(shù)目的差異；還發(fā)現(xiàn)同一種內(nèi)不同菌株之間基因差異與基因水平轉(zhuǎn)移有關(guān)，也就是說某個菌株的獨有基因很可能是從別的細菌中水平轉(zhuǎn)移而來，這樣就造成了種內(nèi)基因多樣性，而這些差異基因大多都和一些特殊的表型有關(guān)，比如耐藥、毒力等。因此，全基因組學(xué)研究不僅可以進行種內(nèi)、種間的進化關(guān)系研究，還可以闡明分子致病機制，篩選、鑒定致病相關(guān)基因，為開發(fā)研究疫苗、新型抗生素提供新的策略。

1 布魯氏菌基因組構(gòu)成

布魯氏菌屬在分類上屬根瘤菌目、布魯氏菌科，各生物型的G+C含量為55%～59%，DNA高度同源，同源性均在90%以上，基因組大小和組成異常相似[2]，除B.suis 3型菌的基因組僅含1條大小為3.2 Mb染色體外，其余布魯氏菌的基因組均由2條獨立且完整的環(huán)狀DNA染色體組成，大小分別為2.1 Mb和1.2 Mb。在2.1 Mb的大染色體上含有1個復(fù)制起始區(qū)，1.2 Mb的小染色體上含有1個質(zhì)粒復(fù)制功能區(qū)[3]。通常編碼3 200～3 500個開放閱讀框[4]。

2 布魯氏菌基因組特征

布魯氏菌的基因組中無質(zhì)粒、無溫和噬菌體，有插入序列(IS)，但各個種型的拷貝數(shù)不同，從7個拷貝到30個拷貝不等。此外，還有較短的重復(fù)回文序列存在，而短重復(fù)回文序列、單核苷酸多態(tài)性、插入序列則是布魯氏菌基因組多態(tài)性的主要來源。另外，布魯氏菌基因組中還存在假基因，不同菌株中假基因的數(shù)量差別很大,田鼠型布魯氏菌假基因最少，僅有63個；而牛種布魯氏菌2 308則多達316個,假基因的積累反映了菌株的適應(yīng)性進化。布魯氏菌屬的基因組成、特征基本相似，但各個種型之間稍有差別，而細微的差異使他們的致病性、毒力、環(huán)境適應(yīng)性等各不相同，而這些細微的差異或許正是致病性和毒力差異的所在，系今后研究的立足點。

2.1 主要致病布魯氏菌全基因組測序分析 全基因組測序分析不僅可用于基因遺傳特性分析，還是一種強有力的基因分析工具，在鑒別和篩選布魯氏菌差異基因、致病基因中具有重要的作用。牛種菌A13334的全基因組為3.3 Mb，由2條染色體組成,長度分別為2.1 Mb(ChrI)和1.2 Mb(ChrII)；G+C含量均為 57%；約有3 338個編碼基因，其中2 182個位于染色體1，另1 153個位于染色體2；2條染色體約85%～87%的基因可以編碼蛋白；基因組中有55個tRNA 基因 (其中41個位于1號染色體，14個位于2號染色體) 和 9個 rRNA基因(其中6 位于1號染色體，3個位于2號染色體)[5]。羊種布氏菌 ADMAS-G1的基因組全長為3.3 Mb，G+C含量為57.3%，編碼3 388個基因，其中3 325個是蛋白編碼基因，2 610個為功能蛋白、715為假設(shè)蛋白。預(yù)測有RNA 基因63個，包括 57個tRNA 和6個rRNA 基因。58個基因與致病機制有關(guān)，virBIII型,IV和V分泌路徑以及獨立蛋白組件TatC分泌應(yīng)答等相關(guān)路徑；另有44個防御機制基因，其中包括負責(zé) ABC 型藥運輸系統(tǒng)、多藥耐外排泵、限制性內(nèi)切酶等基因[6]。羊種布魯氏菌BmIND1的基因組有3 284 360個堿基，有3 360個蛋白編碼基因，G+C含量為57.2%，包含49個tRNA、3個rRNA和964個直系同源基因(KEGG)。另外，研究還發(fā)現(xiàn)有58個基因具有分泌功能并可能參與宿主-病原體相互作用[7]。多個致病布魯氏菌株的全基因組測序分析極大的豐富布魯氏菌基因組信息，對篩選和識別布魯氏菌致病基因及毒力島有重要的意義。

2.2 非主要致病布魯氏菌的全基因組測序分析 目前，絕大多數(shù)的布病由羊種菌和牛種菌引起，而豬種菌、犬種菌等非主要致病菌的全基因組測序分析有助于了解布魯氏菌的進化、變異以及致病差異等相關(guān)信息。犬種布魯氏菌SVA13的基因組G+C含量為57.24%，2條環(huán)狀染色體分別為2.1 Mb和1.2 Mb。全基因組包含3 093個基因，其中2 950個為編碼基因，有5S、16S和23S RNA 3種核糖體，16個操縱子、1個非編碼基因、55個tRNA 操縱子。在基因組中有57個移碼突變。1號染色體包含60個長度>8個堿基的重復(fù)串聯(lián)序列，2號染色體中有30個長度為2～264個堿基拷貝數(shù)為2～11的串聯(lián)重復(fù)序列[8]?；蛐蜑镾T26型的鯨魚型布氏菌TE10759-12的基因組G+C含量為57%,基因組由2條染色體組成，分別為2.1 Mb和1.2 Mb。另外，有9個完整的rRNA，44 個轉(zhuǎn)運操縱子和2 611個編碼基因[9]。在豬種4型菌NCTC10385、鯨魚型菌NCTC12891T、B.inopinatastrain CAMP 6436T和沙林鼠種ATCC23459T的基因組內(nèi)均檢測到了串聯(lián)重復(fù)序列，其中豬種4型菌有84個串聯(lián)重復(fù)序列，最大出現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)為4，而鯨魚型、沙林鼠種和B.inopinata的串聯(lián)重復(fù)序列分別為55,49和63個，串聯(lián)重復(fù)頻率分別為7、10和7[10]。基因組序列中的插入/缺失事件可能在不同宿主偏好性上有一定影響，進而與其致病性有一定的關(guān)聯(lián)。非主要致病性布魯氏菌與牛羊布魯氏菌的全基因組特征幾乎相似，而致病性卻相差甚遠，作者認為篩選兩者之間的差異基因或非編碼基因是解開致病性差異的候選方法，而布魯氏菌基因組測序是揭開布魯氏菌之謎的絕佳路徑。

3 布魯氏菌野毒株比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)不僅可以進行全基因組的比較和系統(tǒng)發(fā)生的進化關(guān)系分析，還可進行細菌基因組多態(tài)性的研究，從而揭示基因潛在的功能、闡明物種進化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)[11]。牛種野毒株9-941、豬種1 330和羊種16 M的比較基因組學(xué)研究表明，它們的基因組十分相似，基因含量和基因組成幾乎相同，99%以上的氨基酸序列相同，基因組的開放閱讀框個數(shù)也極為相近，它們的主要區(qū)別來自于sORFs和大的插入刪除，該發(fā)現(xiàn)為確定布魯氏菌的致病性和毒力表型提供了重要依據(jù)[12]。1株ST8型羊種菌的比較基因組學(xué)研究結(jié)果顯示，該菌株共有182處小的缺失和102處插入，并預(yù)測有2 836個單核苷酸多態(tài)性[13]。對羊種強毒株M28-12和羊種疫苗株M5、M111以及豬種菌S2的比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)M5、M28-12和 M111共有1 370個單核苷酸多態(tài)性，其中89個來自 M5和M111以及M28-12，61個來自豬種1330和豬種菌S2，并指出這些多核苷酸多肽性位點可能來自于疫苗株的突變，對設(shè)計新的更加安全的疫苗具有重要的啟示[14]。牛種菌BCB027與牛種菌強毒株相比，基因組中有137個小的缺失，其中有34個位于編碼區(qū)；有3 507個多態(tài)性位點，其中2 731個位于編碼區(qū)，表明從非主要宿主體分離的菌株在遺傳方面有較大的改變[15]。牛種菌A13334與牛種9-941和Rb51相比有48個特有基因；與104M基因組高度相似，但毒力差異較大，差異可能系由某些基因片段的丟失和水平轉(zhuǎn)移有關(guān)。A13334基因組特有的37個基因中絕大多數(shù)基因編碼涉及維持生命周期的多種酶類，其余則直接或間接的與毒力相關(guān)，而這些基因的丟失可能是104M毒力衰減的原因之一[16]。布魯氏菌的比較基因組學(xué)研究加快了新的功能基因和主要致病差異基因的發(fā)現(xiàn)，進而為研究布魯氏菌致病等相關(guān)機制提供了參考。

4 布魯氏菌疫苗株S19比較基因組學(xué)

為了揭開S19是有何種遺傳特性使得其可以作為疫苗保護牛群以及強毒株導(dǎo)致流產(chǎn)的秘密，研究者對S19進行了全基因組測序，并通過對新獲得的S19基因組信息和牛種菌9-941以及2 308的基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)有24個基因與布魯氏菌的毒力相關(guān)，其中有4個基因與毒力直接關(guān)聯(lián)，這4個獨立關(guān)聯(lián)基因在強毒株中編碼外膜蛋白、三赤蘚糖醇的吸收或代謝相關(guān)蛋白質(zhì)基因。該研究不僅將對了解布魯氏菌細胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、蛋白轉(zhuǎn)運和代謝機制的特點有極大的幫助，也為闡明S19作為疫苗候選株具有良好的免疫保護和證實其他菌株具有致病性提供了佐證[17]。布魯氏菌比較基因組學(xué)已經(jīng)成為研究布魯氏菌基因組的有力方法，在布魯氏菌篩選毒力基因、預(yù)測重要基因和蛋白方面發(fā)揮了重要作用。然而，作者認為傳染病實際上是致病決定基因功能的表現(xiàn)，今后的比較基因組學(xué)研究重點在于致病決定基因的比較和篩選。

5 布魯氏菌進化基因組學(xué)

進化基因組學(xué)是通過研究生物進化過程中基因組的動態(tài)變化和基因的變異，從而揭示生物類群的親緣關(guān)系和進化規(guī)律[18]。通過進化足跡特征及直系、旁系同源評估等預(yù)測布魯菌祖先屬于需氧、可自由生活、能運動的異養(yǎng)生物，棲息于根瘤菌植物中[19]?；诮壘甑谋容^分析推測，布魯氏菌及其祖先是一種能自由生活的生物有機體，之后逐漸進化為動物寄生菌。目前準(zhǔn)確的進化進程仍然是未知的，但研究顯示與布魯氏菌基因組中基因的缺失、獲得和修飾等有關(guān)[20]?；谌蚪M序列的進化分析顯示，綿羊附睪種是一種比較古老的布魯氏菌，而牛種和羊種布魯氏菌則是分化程度較高的種；通過比較種系發(fā)育推測牛種菌和羊種菌有共同祖先[21]。布魯氏菌基因組不僅缺乏種內(nèi)重組的依據(jù)，而且基因組中的部分差異區(qū)段具有外源DNA的特征,且在差異區(qū)段在不同菌株中的分布不同,表明這些差異區(qū)段是從外部獲得的；與基于看家基因的進化樹相比,部分差異區(qū)段在不同種型間呈現(xiàn)規(guī)律性的分布，而另外一些并未隨進化關(guān)聯(lián)而呈現(xiàn)獲得與缺失的規(guī)律性變化，表明基因的獲得與缺失可能與布氏菌的適應(yīng)性進化相關(guān)[22-23]。布魯氏菌進化基因組不僅對了解布魯氏菌的種內(nèi)、種間進化，推測菌種起源有重要作用，而且對闡明布魯氏菌的微進化及適應(yīng)性進化機制具有重要意義。

6 結(jié) 語

當(dāng)前，布魯氏菌基因組學(xué)已成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點和研究的重點，隨著細菌基因組測序技術(shù)的進一步發(fā)展成熟，基于新一代高通量測序技術(shù)的全基因組測序，不僅可以預(yù)測布魯氏菌的重要基因、蛋白以了解其功能和可能機制；同時，在布魯氏菌的致病性和防治方面，可以鑒定致病相關(guān)基因、開發(fā)和研究疫苗、開發(fā)新型抗生素等；在布魯氏菌的遺傳進化方面，可以研究種內(nèi)、種間進化關(guān)系、了解進化規(guī)律；還可成為研究布魯氏菌遺傳進化機制和預(yù)測篩選關(guān)鍵基因的重要工具。因此，布魯氏菌基因組學(xué)研究必將在布病的防治研究工作中發(fā)揮重要作用。

[1]Pappas G, Panagopoulou P, Christou L, et al.Brucellaas a biological weapons[J]. Cellular Mol Life Sci, 2006, 63(19/20): 2229-2236.

[2]Sriranganathan N, Seleem MN, Olsen SC, et al. Genome mapping and genomics in animal--associated microbes[M]. Berlin: Springer, 2009:16-20.

[3]Paulsen IT, Seshadri R, Nelson KE, et al. TheBrucellasuisgenome reveals fundamental similarities between animal and plant pathogens and symbionts[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(20): 13148-13153.

[4]DelVecchio VG, Kapatral V, Redkar RJ, et al. The genome sequence of the facultative intracellular pathogenBrucellamelitensis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(1): 443-448.

[5]Kim H, Jeong W, Jeoung HY, et al. Complete genome sequence ofBrucellaabortusA13334, a new strain isolated from the fetal gastric fluid of dairy cattle[J]. J Bacteriol, 2012, 194(19): 5444. DOI: 10.1128/JB.01124-12

[6]Shome R, Krithiga N, Muttannagouda RB, et al. Draft genome sequence ofBrucellamelitensisstrain ADMAS-G1, isolated from placental fluids of an aborted goat[J]. Genome Announc, 2013, 1(5): e00809-13. DOI: 10.1128/genomeA.00809-13

[7]Rao SB, Gupta VK, Kumar M, et al. Draft genome sequence of the field isolateBrucellamelitensisstrain Bm IND1from India[J]. Genome Announc,2014, 2(3): e00497-14. DOI: 10.1128/genomeA.00497-14

[8]Kaden R, Agren J, Ferrari S, et al. Whole-genome sequence ofBrucellacanisstrain SVA13, isolated from an infected dog[J]. Genome Announc, 2014, 2(4): e00700-14. DOI: 10.1128/genomeA.00700-14

[9]Ancora M, Marcacci M, Orsini M, et al. Complete genome sequence of a Brucella ceti ST26 strain isolated from a striped dolphin (Stenellacoeruleoalba) on the coast of Italy[J]. Genome Announc, 2014, 2(2): e00068-14. DOI: 10.1128/genomeA.00068-14

[10]Wahab T, Ferrari S, Lindberg M, et al. Draft genome sequences ofBrucellasuisbiovar 4 strain NCTC 10385,Brucellacetistrain NCTC 12891T,Brucella inopinata strain CAMP 6436T, andBrucellaneotomaestrain ATCC 23459T[J]. Genome Announc, 2014, 2(5): e00783-14. DOI: 10.1128/genomeA.00783-14

[11]Song XM,Li HB,Du LX.Comparative genomics: Research fields and applications[J].Chem life,2006,26(5):425-427. (in Chinese) 宋雪梅,李宏濱,杜立新.比較基因組學(xué)及其應(yīng)用[J].生命的化學(xué),2006,26(5)425-427.

[12]Halling SM,Peterson-Burch BD,Bricker BJ.Completion of the genome sequence ofBrucellaabortusand comparison to the highly similar genomes ofBrucellamelitensisandBrucellasuis[J]. J Bacteriol,2005, 187(8): 2715-2726.

[13]Li TF, Yuan XT, Ding JB, et al. Genome sequence ofBrucellamelitensisstrain 128, an isolate of biovar 3 of sequence type 8[J]. J Bacteriol, 2012, 194(24): 6960. DOI: 10.1128/JB.01819-12

[14]Ding JB, Pan YL, Jiang H, et al. Whole genome sequences of fourBrucellastrains[J]. J Bacteriol, 2011, 193(14): 3674-3675. DOI: 10.1128/JB.05155-11

[15]Wang L, Qiu Y, Chen Z, et al. Draft genome sequence ofBrucellaabortusBCB027, a strain isolated from a domestic deer[J]. Genome Announc, 2013, 1(1): e00130-12. DOI: 10.1128/genomeA.00130-12

[16]Yu D, Hui Y, Zai X, et al. Comparative genomic analysis ofBrucellaabortusvaccine strain 104M reveals a set of candidate genes associated with its virulence attenuation[J]. Virulence, 2015, 6:1-24.DOI:10.1080/21505594.2015.1038015

[17]Crasta OR, Folkerts O, Fei Z, et al. Genome sequence ofBrucellaabortusvaccine strain S19 compared to virulent strains yields candidate virulence genes[J]. PLoS One, 2008, 3(5): e2193. DOI: 10.1371/journal.pone.0002193

[18]Zhou DS,Yang RF.Comparative and evolutionary genomics in bacterial systems[J].J microbiol,2003, 23(5):31-34. (in Chinese) 周冬生,楊瑞馥.細菌比較基因組學(xué)和進化基因組學(xué)[J].微生物學(xué)雜志,2003, 23(5):31-34.

[19]Zhong ZJ, Yu S, Xu J, et al. Progress in the evolution and taxonomy ofBrucella[J]. Chin J Vet Sci, 2011, 31(8): 1228-1240. (in Chinese) 鐘志軍,于爽，徐杰,等.布魯菌進化和分類學(xué)研究進展[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2011,31(8):1228-1240.

[20]Ficht T.Brucellataxonomy and evolution[J]. Future Microbiol, 2010, 5(6): 859-866. DOI: 10.2217/fmb.10.52

[21]Fekete A，Bantle JA，Hailing SM，et al.Amplification fragment length polymorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primers[J].J Bacteriol,1992，174(23):7778-7783．

[22]Foster JT, Beckstrom Sternherg SM, Pearson F, et al. Whole genome-based phylogeny and divergence of the genusBrucella[J]. J Bacteriol, 2009, 191(8): 2864-2870.

[23]Yang Y. Gene lost and found among different biotypes ofBrucellaspecies in the process of evolution[D]. Beijing: Academy of Military Medical Science,2011. (in Chinese) 楊毅.不同種型布魯氏菌進化中基因獲得與缺失研究[D].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2011.

Progress in genomic research ofBrucella

LIU ZHi-guo1,2,3,WANG Miao3,CUI Bu-yun4,LIU Ri-hong3,XIA Xian-zhu5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot01008,China; 2.UlanqabBureauforHealth,Ulanqab012000,China; 3.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControl,Ulanqab012000,China; 4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPreventionCollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China; 5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

Brucellais a gram-negative, intracellular bacterium. Lacking of classical virulence factors, pathogenesis was not only relying on the invasiveness and endotoxin, but also depends on the strong ability to adapt to the environment. At present, the mechanisms of invasion of the body and in the intracellular of continued presence is not clear. TheBrucellagenomic research can not only fully explain the characteristics ofBrucellagene composition, molecular evolution, virulence factors and pathogenic mechanism, but also be used for some of the pathogenic genes and important protein prediction. And to offered candidate loci for further reasearch. Meanwhile, provided a molecular basis for the research and development of new vaccines and antibiotics, so as to supply a theoretical basis for the construction of new effective treatment and prevention strategies of brucellosis. This is an overview of genomic forBrucella, includeBrucellagenome composition and characteristics, analysis of the whole genome sequencing, comparative genomic, and evolutionary genomics research progress.

Brucella; genomic; comparative genomics; evolution genomics

s: Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn; Cui Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.018

夏咸柱,Email:xiaxzh@cae.cn 崔步云,Email:cuibuyun@icdc.cn

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 10018; 2.烏蘭察布市衛(wèi)生局，烏蘭察布 012000; 3.烏蘭察布市地方病防治中心， 烏蘭察布 012000; 4.中國疾控中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室，感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206; 5.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122

R378.5

A

1002-2694(2015)12-1177-04

2015-03-12；

2015-06-11

內(nèi)蒙古衛(wèi)計委醫(yī)療衛(wèi)生科研項目(No.201301094)資助

Funded by the Medical and Hygiene Research Projects of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission (No. 201301094)