微小胞外囊泡對固有免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)①

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.031

微小胞外囊泡對固有免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)①

沈朝斌蔡紅郁蘭綜述

(上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200082)

中圖分類號R392.2

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1578-07

①本文受上海市中醫(yī)藥發(fā)展辦公室中西醫(yī)結(jié)合重點病種(zxbz2012-003)資助。

作者簡介：沈朝斌(1961年-),男,主任醫(yī)師,教授,碩士生導師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合免疫調(diào)節(jié)研究,E-mail:sbsys1303@aliyun.com。

機體為應對外來病原體進行防御和有效的應答，不同的免疫細胞必須進行互相間的交流。細胞間的交流分3類。(1)直接接觸，通過膜上的受體和配體；(2)通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌等釋放可溶性分子，作用于靶細胞受體。(3)通過EV釋放信號分子[1,2]。隨著EV組成和功能的深入研究，揭示了第3類廣泛的細胞間交流方式。目前已有成熟的EV研究方法，可以了解其作為轉(zhuǎn)運載體在細胞間的信息交換，EV包含了不同的生物學活性分子，包括蛋白、脂質(zhì)和核酸(主要是小RNA)[2]。通過囊泡的細胞間交流能調(diào)節(jié)生理和病理過程[3]。EV在免疫細胞的作用值得重視，已有許多體內(nèi)外研究結(jié)果提供了充分的證據(jù)[4]。

1EV在細胞間交流的作用

EV是指所有來源于細胞分泌的存在于細胞外的囊泡。大量細胞均釋放EV，包括在體外培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液表面和多種體液中(如：血液、尿液和母乳等)[5-7]，同樣的EV可來自不同的細胞亞型。EV能形成向內(nèi)芽生方式的有膜包被的內(nèi)體小泡，稱之為多囊泡體(Multivesicular bodies，MVBs)，然后帶著細胞膜釋放到細胞外，這些EV被稱作外泌體(Exosome)，直徑在50~100 nm。同時，EV也能直接從細胞膜通過朝外芽生的方法形成。這些囊泡直徑可大至1 μm，經(jīng)常被稱之為微囊(Microvesicu-lar)。按目前現(xiàn)有技術，尚無可能從微囊中分離出外泌體。在細胞培養(yǎng)上清液和體液中找到的EV在大小、形狀和分子含量經(jīng)常因來源不同而各異。EV組成依賴于供體細胞的種類、分化和活化狀況，與微囊的產(chǎn)生過程有關[8]。EV被脂質(zhì)雙層結(jié)構包裹著，以保護囊內(nèi)信息分子不被細胞外環(huán)境所降解。EV膜上具有生物活性的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，保護這些囊泡送達靶細胞，并將EV信號傳導到靶細胞。EV的蛋白質(zhì)種類與不同細胞來源有關。EV蛋白包括：跨膜四蛋白家族、轉(zhuǎn)膜蛋白和骨架構件[9]。另外，EV也包含了不同細胞產(chǎn)生的特殊蛋白，如APC分泌的MHCⅡ分子[10]。EV相關的核酸主要是小RNA。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞EV攜帶了線粒體DNA(mitochondrial DAN,mtDNA)[11]，最新研究還發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞株和患者血清來源的EV含有>10 kb雙鏈DNA片段[12]。EV作為多信號成分傳遞裝置能根據(jù)受體細胞功能調(diào)節(jié)和釋放信息。體液中的EV表達可作為檢測疾病的一個潛在臨床生物學指標，不同疾病狀態(tài)下EV表達的種類和含量均不同。來自于樹突狀細胞的囊泡已被應用于腫瘤疫苗臨床試驗中[13]。

2EV在免疫系統(tǒng)的介導作用

EV在先天性免疫和獲得性免疫應答之間起著一種調(diào)節(jié)作用[1,4,8]。EV在免疫系統(tǒng)中的不同作用與它們所包含的生物活性相關分子有關。免疫細胞來源的EV具有免疫刺激或免疫下調(diào)作用[4,8]。EV的免疫活化功能包括抗原提呈(通過APC細胞來源的EV)和前炎癥細胞因子的釋放(通過不同免疫細胞來源的EV)。另一方面，來自于DC耐受和誘導性T細胞凋亡的EV能誘導免疫抑制。免疫系統(tǒng)中EV介導功能大多在體外實驗被證明，然而在不同生理和病理狀況下的EV體內(nèi)功能仍然不清楚。在系統(tǒng)性炎癥疾病中，不同來源的EV可能具有不同的病理作用[14,15]。

EV釋放并被受體細胞攝入，從而在細胞間進行信息交流。在這過程中它的有效性和特異性仍具有不確定性。一次EV釋放，通過一種旁分泌方式傳遞給鄰近的細胞，或者類似于特異性細胞免疫突觸的方式對細胞進行作用。免疫突觸是指在細胞間互相作用接觸區(qū)域形成具有高度組織性的超分子結(jié)構，如：T細胞與APC細胞的相互作用以及NK細胞和靶細胞的互相作用方式[16]。T細胞來源的囊泡能通過免疫突觸轉(zhuǎn)移給APC細胞，表明這些突觸也可以轉(zhuǎn)運EV[17,18]。其他先前的研究結(jié)果也表明EV的轉(zhuǎn)運存在雙相模式，即可檢測到DC釋放的EV存在于T細胞的表面[19,20]。研究觀察到的通過突觸轉(zhuǎn)運的EV是細胞培養(yǎng)上清液中的EV，是細胞間互相作用接觸區(qū)域形成并釋放的部分。

除了短途轉(zhuǎn)運的EV，它也能通過體液遠距離起作用。相對于局部釋放的EV，通過體液循環(huán)到達靶組織器官，具有特異的靶向作用。對于全身播散性的微囊，靶向特異性可能更依賴受體細胞的選擇性應答，這意味著僅僅是針對限定的細胞亞群或組織種類才可能獲得或?qū)ξ⒛抑邪男畔a(chǎn)生應答。靶細胞是通過EV表面的四跨膜蛋白和整合素與之結(jié)合[21-23]。EV與淋巴細胞和組織中所包含的多種分子具有靶向作用。在淋巴結(jié)中，DC來源的EV與LFA-1和ICAM-1的結(jié)合對T細胞以及CD8+細胞的活化十分重要[21]。在淋巴結(jié)髓質(zhì)和被膜竇以及脾臟邊緣區(qū)的巨噬細胞上的唾涎酸黏附素(CD169)均能與B細胞來源EV表面的2,3-唾涎酸結(jié)合，表明這些EV可以調(diào)控淋巴組織[26]。另外，DC來源的EV攜帶了補體C3片段或乳凝集素(MFG-E8)[25,26]，在淋巴器官邊緣區(qū)的B細胞和濾泡狀DC上有CD21補體受體的表達，可能有助于有效地捕獲這些具有調(diào)理作用的EV[26,27]。綜上所述，EV選擇性靶向與細胞結(jié)合依賴于特異的分子間相互作用。

3EV RNA和DNA的來源及調(diào)節(jié)固有免疫的作用

3.1EV富含非編碼RNA近年來，許多研究表明不同細胞釋放的EV均含有RNA。EV相關的RNA主要由小RNA組成(<200 bp)，但也被檢測到選擇性mRNA和長鏈非編碼RNA(long-non-coding RNAs，lncRNAs)的存在[28]。2007年Valadi等[29]首次報道了EV相關RNA轉(zhuǎn)運給靶細胞，他們的研究表明小鼠mRNA能通過EV轉(zhuǎn)移給人類的受體細胞。通過EV水平傳播遺傳編碼信息是目前新確定的細胞間信號傳導方式。

許多研究著重于EV中的microRNA(miRNA)。將EV和它們供體細胞的miRNA譜進行比對，發(fā)現(xiàn)有些miRNA是通過EV優(yōu)先釋放的，與此相反，其他的miRNA(如：miR-218)是保留在細胞中的[30-32]。EV相關的miRNA經(jīng)常包含了供體細胞特殊的miRNA。例如：有些細胞miR-451和miR-150是優(yōu)先從EV中排出，這些細胞包括：上皮細胞、腫瘤細胞和間充質(zhì)干細胞等。miR-142-3p是上皮細胞優(yōu)先排出的，而不是通過免疫細胞(如：DC、T和B淋巴細胞)排出的[31]。這些微囊和細胞的miRNA譜的差異表明，EV有些RNA分子是被選擇性組裝進入EV的。多項研究指出RNA被選擇性組裝的機制。miRNA摻入的選擇性并不是互補mRNA序列共分離(co-segregation)的結(jié)果，而是使用微囊中的miRNA抑制mRNA轉(zhuǎn)錄機制來解釋的[33,34]。RNA誘導的靜默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)參與了miRNA前體形成過程，并有利于miRNA介導靶mRNA的降解。從外泌體中出現(xiàn)的生理性聚集的MVBs檢測到多種蛋白復合物，說明miRNA整合進入EV可能包含了RISC[33,35]。目前有更直接的證據(jù)表明，RNA和RNA結(jié)合蛋白是選擇性地進入EV的。T細胞釋放的EV miRNA短的共同基序，這些基序與不均一的核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1)結(jié)合，并將特殊的miRNA載入EV[36]。

除了mRNA和miRNA，EV還含有其他RNA種類。近來對免疫細胞來源的EV采用深度測序表明，EV還存在特征性的小RNA(<70 bp)。這些囊泡中含有大量不同的小的非編碼RNA(small non-code RNA,sncRNA)種類。除了少量相關的miRNA，可檢測到對蛋白質(zhì)編碼區(qū)域注釋部分的廣泛轉(zhuǎn)錄或裂解產(chǎn)物，也可檢測到重復序列或結(jié)構RNA[核蛋白復合物行使基本細胞功能的RNA，如：信號識別顆粒(Signal recognition particle,SRP)RNA和穹窿RNA(Vault RNA)][37]，許多小RNA類似于tRNA和mRNA降解的片段[38]，被認為具有基因調(diào)節(jié)功能[39,40]。在神經(jīng)細胞、尿液和血漿中的EV也被檢測到小的tRNA和小的Vault RNA[41,42]。

另外，EV中也被檢測到存在lncRNA。雖然大部分lncRNA的功能尚不明確，但有些lncRNA已被明確具有很強的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運和表觀遺傳修飾等調(diào)節(jié)作用[43]。近期研究資料顯示，在細胞內(nèi)低表達的特殊的lncRNA在EV中有較高的含量[44]。EV中l(wèi)ncRNA的證據(jù)主要來自于小細胞肝癌的研究[45,46]。小細胞肝癌來源的EV含特殊的lncRNA，它來源于TGF-β介導的對化療耐藥的肝癌，這些EV含有的lncRNA促進了腫瘤生長[46]。因此，小RNA和lncRNA代表了這類調(diào)節(jié)性RNA，它們對基因的調(diào)節(jié)作用甚至已超過了miRNA的活性。

多個研究表明，EV介導免疫細胞釋放的miRNA均有下調(diào)受體細胞靶基因表達的作用[17,47,48]。在這些研究中，EV過度表達的miRNA可抑制靶mRNA，經(jīng)熒光素酶(Luciferase)標記發(fā)現(xiàn)，miRNA轉(zhuǎn)染受體細胞的部位在3′UTR。目前尚無很好的方法去明確在體內(nèi)EV轉(zhuǎn)運RNA的作用。今后的研究方法必須是既能干擾阻止細胞釋放EV，而又不影響其他微囊泡介導作用。這需要增加對靶細胞的囊泡分泌、裝載和釋放其中封閉的信號分子機制的了解。

3.2在固有免疫系統(tǒng)中的EV大量的研究集中于細胞釋放的EV在獲得性免疫中的作用[4,8]。而對EV在調(diào)節(jié)固有免疫方面的研究才剛剛起步[8,49]。固有免疫也被非免疫細胞釋放的以及體液中不明來源的EV所影響。巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞和NK細胞是已知的釋放EV的先天性免疫細胞，釋放的EV具有調(diào)節(jié)免疫應答作用。肥大細胞在分泌的顆粒中釋放EV，也同時釋放炎癥介質(zhì)和蛋白酶[50]。這些EV含有MHCⅡ類分子和特殊的熱休克蛋白，它們具有抗原提呈、DC成熟和誘導Th1應答的作用。細菌感染的巨噬細胞釋放的EV具有免疫活化作用[51]，它能活化鄰近的巨噬細胞和誘導DC的成熟。與此相反，中性粒細胞釋放的EV通過抑制巨噬細胞和非成熟的DC產(chǎn)生前炎癥因子來下調(diào)非特異性炎癥[52]。

3.3EV的miRNA對固有免疫應答的調(diào)節(jié)影響最初的研究結(jié)果表明，肥大細胞釋放的EV所含miRNA和mRNA轉(zhuǎn)運到靶細胞是EV-RNA的介導作用[29]。該研究是通過將肥大細胞暴露在氧化應激條件下產(chǎn)生EV而明確此作用的[53]。這些EV能將氧化應激的耐受性轉(zhuǎn)運給受體細胞，紫外光對RNA降解可抑制這個作用。多個研究證明，單核/巨噬細胞釋放的EV所含miRNA可將功能轉(zhuǎn)運給不同類型的靶細胞。這些miRNA功能轉(zhuǎn)運依賴于產(chǎn)生EV的細胞活化狀況和受體細胞的類型。來自單核THP-1細胞株的EV的 miR-150可以將血管增生調(diào)節(jié)作用功能性轉(zhuǎn)運給人微血管上皮細胞HMEC-1株[54,55]。miRNA對供體細胞和受體細胞均有干擾作用，EV介導的miR-150有促進受體細胞形成管腔作用。多個研究報道了巨噬細胞釋放EV中的miR-223具有調(diào)節(jié)髓樣細胞增殖/分化和腫瘤進展功能[56-58]。Ismail等[48]研究表明，巨噬細胞來源的EV誘導了靶向單核細胞的分化。該研究證明了，巨噬細胞來源的EV釋放的內(nèi)源性miR-223對miR-223陰性的并轉(zhuǎn)染了miRNA報告基因載體的靶細胞是有功能性作用的。另外，使用經(jīng)miR-223拮抗劑處理的單核細胞可以降低它們的分化。雖然原因不明，但研究資料強烈提示EV誘導單核細胞分化作用是由miR-223轉(zhuǎn)運引起的。巨噬細胞來源的EV富含miR-223也被Aucher等[59]研究所證實。EV的miR-223能有效轉(zhuǎn)運到肝癌細胞。使用miR拮抗劑和吸附劑去除miR-223，具有抗肝癌細胞增殖的作用。相反，肝癌細胞釋放的EV對先天免疫應答具有調(diào)節(jié)作用，這些EV含let-7b(miRNA的一種)，并轉(zhuǎn)運給巨噬細胞，導致前炎癥因子IL-6釋放減少[60]。

3.4EV相關的miRNA對TLR活化的作用近期研究資料顯示，EV包含的miRNA除了具有調(diào)節(jié)基因的作用外，腫瘤細胞釋放EV所含有的特殊miRNA能作為Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)的配體起作用[61]。腫瘤來源的miR-21和miR-29a能與人的TLR8以及鼠的TLR7結(jié)合，并活化在免疫細胞上的這些受體，導致腫瘤轉(zhuǎn)移前炎癥因子的分泌。近期研究發(fā)現(xiàn)，這些特殊的與EV相關的miRNA來自于腫瘤細胞，并能活化TLRs，而不是非腫瘤細胞的白細胞[62]。這些研究可能解釋了內(nèi)源性的miRNA修飾了TLR活化的途徑，而正常細胞來源的miRNA并不具有這個作用。這種類似于2′-O-甲基化的修飾作用相當于TLR7/8的拮抗劑[63]。它們增加了EV相關RNA在細胞間功能轉(zhuǎn)運另一層面的復雜性。

3.5含RNA微生物的EV對固有免疫應答的調(diào)節(jié)微生物感染細胞釋放的EV具有許多重要作用。來源于感染細胞的EV經(jīng)常含有能被免疫細胞識別的微生物產(chǎn)物。例如巨噬細胞感染微生物后增加了EV的分泌，并使得DC成熟和鄰近巨噬細胞的活化[64]。多種被病毒感染的細胞也影響了EV釋放[65,66]。對病毒而言，EV能促進或抑制病毒的傳播和/或調(diào)節(jié)宿主的抗病毒免疫應答。

多個研究表明病毒感染后的細胞所釋放的EV含有病毒RNA，而這些RNA具有調(diào)節(jié)先天免疫應答的作用。目前已知EB病毒可干擾EV的釋放。在人類皰疹病毒隱匿感染的B細胞和上皮細胞釋放的EV含EB病毒隱匿感染膜蛋白1(EBV Latent membrane protein 1,LMP1)。這種蛋白釋放到周圍非感染細胞起著免疫逃避作用[67]。另外，EB感染細胞后所釋放的EV含有病毒基因組BHRF1和BART基因簇編碼成熟的miRNA[68,69]。這種表達模式與病毒隱匿感染狀態(tài)相關。采用miRNA BHRF1-3和miR-BART15報告結(jié)構對受體細胞進行轉(zhuǎn)染，EV相關的miRNA可被功能性轉(zhuǎn)移到受體細胞，并介導了靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制[68,70,71]。關鍵是EB病毒編碼的miR-BART15的特殊靶點是炎癥復合體(Inflammsome)的一個成分NLRP3，是炎癥初始化過程已知的產(chǎn)生前炎癥因子IL-1β和IL-18的多種蛋白復合物[71]。

EV的miR-BART15最初是在單核細胞THP-1中發(fā)現(xiàn)的，在單核細胞中NLRP3和IL-1β蛋白表達下降[71]。這個研究證明了在EB病毒感染隱匿期EV相關的miR-BART15具有調(diào)節(jié)炎癥反應的作用，通過包含有LMP1和病毒miRNA 的EV將抑制免疫活化作用轉(zhuǎn)移給了鄰近免疫細胞。

除了EB病毒感染，丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染的細胞也釋放含病毒RNA的EV。HCV感染肝臟細胞釋放的EV含有完整的病毒基因組和亞基因組的RNA序列[72]。這些EV釋放給漿細胞樣DC(plasmacytoid DC,pDC)導致了TLR7依賴的干擾素反應。同樣，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)感染的細胞也釋放含LCMV-RNA的EV，并能使pDC產(chǎn)生IFN-α[73]。這種EV介導機制是一種阻止免疫識別病毒的策略，或者是誘導鄰近細胞失去抗病毒應答的一種宿主策略。

近年來研究表明，細菌和寄生蟲也可釋放EV，并能影響宿主與微生物的互相作用以及對免疫調(diào)節(jié)施以影響[74,75]。革蘭氏陰性菌的EV從菌體外膜脫離而被稱之為外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)[76]。多種蠕蟲也釋放EV，但它的形成和釋放機制目前尚不明確[77]。微生物的EV經(jīng)常含有抗原和致病因子，包括TLR配體和NOD樣受體(NOD like receptors,NLR)，NLR能影響被感染的宿主的先天免疫應答。

目前對微生物釋放EV RNA的種類和含量仍不清楚。最近Bayor-Stantos等[77]的研究證實，克魯斯氏錐蟲來源的EV含多種sncRNA。這些EV中存在著源自tRNA的豐富的小RNA[77,78]。研究表明這種tRNA片段對多種生物學功能具有高度調(diào)節(jié)作用[79]，可大大抑制蛋白合成、Argonaute蛋白相關的基因沉默效應以及病毒活性。與EV共同培養(yǎng)，可以將這種特殊的tRNA直接轉(zhuǎn)染給靶細胞，并誘導參與調(diào)節(jié)宿主與寄生蟲生物學過程，如對關節(jié)炎癥細胞因子CXCL2基因編碼進行調(diào)節(jié)[80]。對來源于寄生蟲和前面所述免疫細胞的EV[37]，它們均有豐富的tRNA片段是值得重視的，這意味著EV具有跨越生命物種的特點。目前發(fā)表的EV相關的RNA深度測序研究顯示，富含tRNA片段的包括：克魯斯氏錐蟲和免疫細胞[37]、在精液中人際傳播的細菌[81]。另外，EV相關的RNA深度測序分析尿液[41]、血漿[42]、神經(jīng)元細胞釋放的[34]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞釋放的[82]均含有tRNA序列圖譜。這些序列是否表現(xiàn)為tRNA片段或完整長度的tRNA還有待進一步研究。

3.6含DNA的EV對腫瘤固有免疫的調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的條件之一是免疫系統(tǒng)的損害，但腫瘤對免疫系統(tǒng)，尤其是免疫監(jiān)視的損害機制目前尚不清楚。免疫防御的第一道防線是固有免疫，它們通過體液免疫和肥大細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和髓系細胞等介導的成分來抵御外來入侵。因此，腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移前必然存在免疫應答的損害或免疫微環(huán)境的改變。在腫瘤進展的過程中，EV和其他被分泌的囊泡起著細胞間信息交流的作用。腫瘤細胞的EV含有大量的生物活性分子，包括：蛋白、RNA、miRNA和DNA等，它們使得T細胞免疫原性變得遲鈍或朝著固有免疫細胞表型有利于腫瘤發(fā)生的方向發(fā)展[83]。明確腫瘤進展中EV的作用對腫瘤的治療至關重要。

EV除了含有小RNA外，2010年也首次報道了它也包含了DNA。該研究對骨骼肌C2C12細胞株釋放的EV信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)現(xiàn)EV含有線粒體DNA(mtDNA)[11]。隨后，有研究者在膠質(zhì)瘤細胞系的外泌體中檢測出了少量的單鏈DNA。該研究認為，腫瘤的EV含有一整套的進行水平轉(zhuǎn)錄的遺傳信息，包括：特殊編碼和非編碼的RNA、DNA、突變和癌基因擴增以及轉(zhuǎn)座子等，EV可以作為臨床腫瘤的生物學標記[84]。Kahlert等[12]對胰腺癌細胞釋放的EV中發(fā)現(xiàn)>10 kb雙鏈DNA片段，這些片段是KRAS和p53癌基因的突變產(chǎn)物，在胰腺導管癌中最多見。在全基因組測序中，研究者證明了胰腺癌患者血清的EV含有這些雙鏈DNA片段，在這篇文獻中作者討論了這些雙鏈DNA片段在臨床應用的前景。

4結(jié)論

EV組成了一個高度精細的細胞間信號交流系統(tǒng)，并且廣泛地被免疫細胞所利用。EV是獨特的信息攜帶者，它將選擇性的靶向信號分子組裝在單一的顆粒中，這些顆粒將這些特定的分子信息釋放給指定的受體細胞。EV中包含不同長度的非編碼RNA序列，在體外實驗中這些RNA序列能被功能性轉(zhuǎn)移給先天免疫細胞或非免疫細胞，從而影響先天免疫應答。EV-RNA介導作用包括調(diào)節(jié)前炎癥因子或抗炎癥因子的產(chǎn)生、細胞分化和抗病毒干擾素反應。這類EV相關RNA包括miRNA、tRNA片段以及病毒RNA等。EV介導的多種非編碼RNA進行細胞間的轉(zhuǎn)移是一種新認識的信號交流方式。腫瘤細胞以及患者血清中的EV還含有DNA片段，可能成為可利用的臨床腫瘤生物標志物，是否能成為腫瘤治療和疫苗研制的方向有待進一步研究。

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[收稿2015-05-20修回2015-06-24]

(編輯倪鵬)