食源性致病菌疫苗研究進展①

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.025

·專題綜述·

食源性致病菌疫苗研究進展①

曾海娟宋春美吳淑燕楊標李建武邱實劉箐

(上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海200093)

中圖分類號Q939.91

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1553-04

①本文受國家質檢總局科技項目(GSCIQ_2010IK220)、國家自然科學基金項目(31371776)和上海市科委高校能力建設項目(13430502400)資助。

作者簡介：曾海娟(1990年-)，女，博士，主要從事食源性致病菌快速檢測技術研究，E-mail:zenghaijuan12@126.com。

通訊作者及指導教師：劉箐(1970年-)，男，博士，教授，主要從事食源性致病菌致病機理及快速檢測技術研究，E-mail:liuq@usst.edu.cn。

食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細菌。致病性細菌直接或間接污染食品及水源，人經口感染可導致腸道傳染病的發(fā)生、食物中毒，及畜禽傳染病的流行。常見的食源性致病菌主要有大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyt-icus)、志賀氏菌(Shigella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocyt-ogenes)等。食源性致病菌是引起食品安全問題的重要來源。在一般情況下，食源性致病菌常引起急性中毒，輕者多以急性胃腸炎癥狀出現(xiàn)，如嘔吐、惡心、腹瀉等，較重者可出現(xiàn)呼吸、神經系統(tǒng)等癥狀[1]。

疫苗含有刺激免疫系統(tǒng)的抗原成分，可誘導機體產生抗體并產生記憶性B淋巴細胞，保護機體免受入侵病原體的感染。目前對食源性致病菌的防治主要依賴抗生素，抗生素的使用導致微生物產生耐藥性，并可能使食品存在藥物殘留。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率達33.3%，副溶血性弧菌對四環(huán)素和復方磺胺甲惡唑耐藥率分別為2.1%和3.2%，沙門菌對萘啶酸的耐藥率為50%[2]。研發(fā)高效疫苗，通過免疫途徑提高動物自身免疫力，降低抗生素的使用量，是預防食源性致病菌的有效方法之一。

我國在食源性致病菌傳統(tǒng)疫苗的滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位疫苗的制備上已經取得了一些科研成果，截止到2014年9月19日，山東濱州華宏生物制品有限公司研制的雞大腸桿菌病蜂膠滅活疫苗通過注冊，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)管所與山東濱州華宏生物制品有限公司研制的鴨傳染性漿膜炎、大腸桿菌病二聯(lián)滅活疫苗通過注冊。對于基因工程菌，中國科學院上海生物工程中心研制的仔豬大腸埃希菌K88、K99雙價基因工程滅活疫苗，寧夏大學研制的犢牛、羔羊大腸埃希菌、B型產氣莢膜梭菌基因工程滅活疫苗相繼通過了注冊，軍事科學院生物工程研究所研制的仔豬大腸埃希菌病K88、LTB雙價基因工程活疫苗也通過注冊[3,4]。對于國外，美國輝瑞公司林肯廠研制的仔豬C型產氣莢膜梭菌病、大腸桿菌病二聯(lián)滅活疫苗通過注冊，德國羅曼動物保健有限公司研制的雞腸炎沙門氏菌病活疫苗也通過注冊。近幾年，食源性致病菌新型疫苗的基因工程亞單位疫苗以及核酸疫苗，都具有較好的免疫效果，但仍處于試驗階段，尚無商品化的疫苗投放市場。本文主要對食源性致病菌的傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗的研究進展及優(yōu)缺點做了詳細的綜述。

1傳統(tǒng)疫苗

傳統(tǒng)疫苗即采用病原微生物及其代謝產物，經過人工減毒、脫毒、滅活等方法制成的疫苗，與新型疫苗相對。食源性致病菌的傳統(tǒng)疫苗主要有滅活疫苗、減毒疫苗和亞單位疫苗。

1.1滅活疫苗滅活疫苗主要是采用熱滅活或甲醛滅活制成的疫苗，該疫苗較為安全，具有保護性好，易于貯存運輸?shù)膬?yōu)點。滅活疫苗，由于含有病原體的蛋白或多糖等成分，可通過抗原或佐劑激活途徑使機體對病原體產生獲得性免疫應答[5]。滅活疫苗主要啟動體液免疫作用，其體液免疫作用很強，能產生足夠的抗體，且抗體在機體的維持時間較長。

劉富來等[6]制備腸炎沙門氏菌滅活苗，得出高溫最佳滅活條件為60℃、30 min或50℃、120 min；得出甲醛最佳滅活條件為0.2%的甲醛溶液，37℃滅活24 h。以所制備的滅活疫苗免疫小鼠后，獲得了100%免疫保護率，表明該滅活疫苗制備成功，且是安全有效的。周宸等[7]制備副溶血弧菌滅活苗，以云芝多糖和該滅活苗免疫斜帶石斑魚，可獲得87.6%的免疫保護率。Yousif等[8]采用熱滅活方式制備出血性大腸桿菌疫苗并免疫小鼠，攻毒后顯示出100%保護率。Barman等[9]對6種不同血清型的志賀氏菌進行熱滅活制備混合滅活疫苗，該滅活疫苗經口服免疫豚鼠，24 h后顯示，免疫組中95.8%的豚鼠未出現(xiàn)痢疾癥狀，而對照組全部出現(xiàn)出血性痢疾或痢疾癥狀?？梢?，滅活疫苗的免疫原性良好，且免疫后可得較高的保護率。

1.2減毒疫苗減毒疫苗相對于滅活疫苗，其免疫力較強、作用時間較長。減毒疫苗模擬病原體自然感染的途徑激活Toll樣受體(TLRs)，誘導產生與病原體感染類似的免疫應答[10]，可啟動細胞免疫和體液免疫作用，其免疫作用比較全面，且刺激機體產生抗體所需時間較短，但主要以細胞免疫作用為主，誘發(fā)的體液免疫作用較弱，產生的抗體水平較低，維持時間較短。

潘志明等[11]采用減毒雞沙門氏菌疫苗免疫肉雞，顯示出的免疫保護率≥80%，而對照組100%死亡。孫洋等[12]構建了O157:H7的ler/stx雙基因缺失突變的弱毒疫苗株，以該突變株O157:H7免疫昆明鼠母鼠，所產乳鼠授乳一周后，用O157:H7強毒株攻毒，保護率達81.03%。殷月蘭等[13]構建了單核細胞李斯特菌actA/plcB雙基因缺失的減毒疫苗株，采用該缺失株免疫小鼠，野生型李斯特菌株攻毒后顯示出100%的免疫保護率，表明該疫苗安全性好，免疫保護力強。

1.3亞單位疫苗亞單位疫苗是利用微生物表面的一種或幾種主要抗原成分制成的疫苗，如細菌的外膜蛋白、脂多糖(LPS)、外毒素、胞外蛋白酶等。此類疫苗只含有特異性的保護性抗原，主要誘導產生體液免疫應答，因而毒性低，安全性好，接種后不引起過敏反應或其他副作用。

Satoshi等[14]用PCR方法對EHEC O157的志賀毒素1(Stx1)進行定點突變，突變毒素無Vero細胞毒性，以該突變毒素免疫小鼠后能夠抵抗100倍LD50野生型Stx1的攻擊。Ursula等[15]對大腸桿菌的AB5型志賀毒素的A亞單位進行定點突變(絲氨酸272突變?yōu)楸彼?，突變的A亞單位失去毒性。該毒素純化后免疫小鼠，攻毒后顯示，小鼠獲得80%的免疫保護率，而對照組全部死亡。

2新型疫苗

新型疫苗是采用生物化學合成技術、人工變異技術、分子微生物學技術、基因工程技術等現(xiàn)代生物技術制造出的疫苗，是近年來新發(fā)展的疫苗，其有別于傳統(tǒng)常規(guī)疫苗。目前報道的可用于食源性致病菌的新型疫苗主要有基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗。

2.1基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗是將選定的免疫原或抗原決定簇的編碼基因，通過基因重組技術引入受體細胞內進行表達，并以表達產物純化后制備的疫苗。此類疫苗是基因工程疫苗中最具安全性和穩(wěn)定性的，且具有接種劑量小、免疫原性強的優(yōu)點。基因工程亞單位疫苗主要誘導產生體液免疫應答。

2.1.1單價基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗的單價疫苗是選取致病菌的某個保護性抗原基因表達并純化后制備的疫苗。

王洪斌等[16]克隆并表達了副溶血性弧菌的溶血素基因，對融合蛋白TDH進行純化并脫毒后，免疫真鯛并攻毒，該疫苗對真鯛保護率達50%。Zhang等[17]選取沙門氏菌致病重要的入侵基因invH制備融合蛋白，攻毒后顯示，保護率均在60%以上，與對照組相比差異均極顯著。在此基礎上構建C3d分子佐劑核酸疫苗，可顯著提高小鼠體內的抗體水平，表明C3d是一種安全有效的分子佐劑。Gao等[18]采用基因工程的方法制備EHEC O157:H7的志賀毒素(STXS)的融合蛋白，免疫小鼠后，在50倍LD50攻毒中顯示70%的免疫保護率。

2.1.2多價基因工程亞單位疫苗該疫苗通過將不同的抗原基因聯(lián)到同一載體上，制成多聯(lián)或多價疫苗，使免疫程序簡化，使生產成本降低。

易勇等[19]采用基因工程方法表達了EHEC O157:H7的intimin C300及Stx2B的融合蛋白，融合蛋白及O157:H7全菌抗原的保護率分別為65%和60%。Wen等[20]利用基因工程脫毒方法表達獲得EHEC O157:H7的Stx1和Stx2的類毒素，純化后免疫小鼠產生了針對同型毒素的中和抗體，同時能夠起到抵抗毒素攻擊的作用。Mao等[21]選取副溶血弧菌的兩種外膜蛋白pvuA和psuA的基因進行融合，表達的重組蛋白純化后免疫大黃魚，獲得了75%的免疫保護率。Gu等[22]制備大腸桿菌EspA、Stx2及intimin C300三價重組蛋白，免疫小鼠并攻毒后顯示出93.3%的免疫保護率。張雪寒等[23]構建并表達了含EHEC O157:H7的stxlb及tir基因的重組蛋白，可獲得60%免疫保護率。鄭磊等[24]制備副溶血弧菌高純度融合蛋白FlaA-OmpK，可獲得80%的免疫保護率。

2.2核酸疫苗核酸疫苗是指將重組表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在宿主細胞內表達，產生的抗原蛋白一部分誘發(fā)CD8+細胞毒性T細胞應答的產生，一部分引起CIN+T細胞反應，引發(fā)體液免疫應答，一部分呈遞給B細胞，產生特異性抗體，誘發(fā)體液免疫[25]。核酸疫苗既有減毒疫苗的優(yōu)點又無逆轉的危險，可維持長時間的免疫反應，同時也便于構建多價疫苗[26]，因此也受到越來越多的重視。核酸疫苗中抗原基因的選取與能否產生良好免疫力密切相關，因而往往選擇與致病直接相關的毒理基因構建而成。

2.2.1單價核酸疫苗Liu等[27]從副溶血弧菌基因組中克隆了vps基因并表達后，采用PCR方法使絲氨酸蛋白酶突變失活，將突變基因vps(Ser318-Pro)構建DNA疫苗，該疫苗最高可獲得96.1%的免疫保護率。Li等[28]選取副溶血弧菌的ompK基因制備DNA口服微膠囊疫苗，免疫的黑鯛并攻毒后的免疫保護率為72.3%。

2.2.2多價核酸疫苗Ren等[29]采用基因工程方法獲得大腸桿菌O139的兩個主要毒理因子fedF和stx2e，制備DNA疫苗，該疫苗可提供100%的免疫保護率。

2.2.3二聯(lián)核酸疫苗劉瑞等[30,31]構建含哈維氏弧菌oppA基因和副溶血弧菌的tdh2基因的二聯(lián)DNA疫苗，對副溶血弧菌該疫苗可提供100%的保護率；對哈維氏弧菌該疫苗可提供60%的保護率。將鰻弧菌外膜蛋白基因ompU和副溶血弧菌的tdh2基因進行融合，該DNA疫苗對副溶血弧菌感染的保護率為100%；對鰻弧菌該疫苗最高提供35%的保護率。

在食源性致病菌的疫苗中，應用最廣泛的是傳統(tǒng)疫苗，目前研究最熱的是基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗。基因工程亞單位疫苗具有純度高、產量高、安全性高的優(yōu)點，適用于病原菌難于培養(yǎng)或有潛在致癌性的疫苗研究。核酸疫苗較穩(wěn)定，制備及使用過程簡單方便，易于大批量生產，易于貯存和運輸，免疫效果持續(xù)可靠。

3展望

傳統(tǒng)疫苗中，滅活疫苗使用劑量較大，且誘導的免疫反應水平較低，持續(xù)時間較短，因而需要多次接種。減毒疫苗有可能在動物體內恢復毒力具有潛在的致病危險，且不易貯存，野生型菌株感染也會導致疫苗效果下降。在實際應用中，因傳統(tǒng)疫苗均存在非特異性反應強、保護期短等缺點，這就促使新型疫苗的產生，以期望彌補傳統(tǒng)疫苗的不足并最大化兼?zhèn)鋫鹘y(tǒng)疫苗的優(yōu)點。

隨著生物技術、免疫技術及基因測序的發(fā)展，各種新型基因工程疫苗受到越來越多的關注。但應意識到新型疫苗作為高科技產品，生產成本較高，并涉及基因水平，與人類及環(huán)境的健康及安全密切相關，因而在新型疫苗的開發(fā)、生產等環(huán)節(jié)應引起高度重視。

面對食源性致病菌感染率不斷上升的趨勢，食源性致病菌各類高效、安全、低廉疫苗的研發(fā)及推出具有重要的現(xiàn)實意義。隨著養(yǎng)殖業(yè)生產集約化程度的不斷提高，科研投入的增加和檢測水平的提高，疫苗的市場需求將逐漸增大。同時，應該進一步探索各類食源性致病菌的感染機理，把試驗研究和現(xiàn)實需求結合起來，并充分發(fā)揮各種疫苗的優(yōu)勢。相信在可預見的將來，會有更多成本低、制備及使用簡單方便、免疫力強、保護期長的新型疫苗誕生，給疾病的預防和治療帶來新的進展與希望。

參考文獻：

[1]趙靜,孫海娟,馮敘橋.食品中食源性致病菌污染狀況及其監(jiān)測技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報,2013,4(5):1353-1360.

[2]秦思,沈贅,馬愷,等.2012年江蘇省食源性致病菌耐藥監(jiān)測分析[J].江蘇預防醫(yī)學,2014,25(1):28-30.

[3]智海東,王云峰,陳洪巖.我國獸用基因工程疫苗研發(fā)現(xiàn)狀與策略[J].動物醫(yī)學進展,2011,32(6):174-178.

[4]鄧秋紅,丁春宇,劉玉倩,等.我國獸用基因工程疫苗商品化進展[J].中國獸藥雜志,2013,47(6):59-63.

[5]Iwasaki A,Medzhitov R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system[J].Science,2010,327(5963):291-295.

[6]劉富來,馮翠蘭,吳智慧,等.腸炎沙門氏菌滅活苗制作和應用[J].中國獸醫(yī)雜志,2005,41(1):49-51.

[7]周宸.云芝多糖和副溶血弧菌滅活苗對斜帶石斑魚免疫功能的影響[J].海洋漁業(yè),2010,32(3):297-302.

[8]Yousif AA,Al-taai NA，Mahmood NM.Humoral and cellular immune response induce byE.coli[O157:H7 and O157:H7:K99] vaccines in mice[J].Int J Immunol Res,2013,1(3):17-20.

[9]Talbot UM,Paton JC,Adrienne W.Protective immunity by oral immunization with heat-killedShigellastrains in a guinea pig colitis model[J].Microbiol Immunol,2013,57:762-771.

[10]吳星,邵杰,張軍楠,等.疫苗誘導機體免疫應答機制研究[J].微生物學免疫學進展,2013,41(1):47-50.

[11]潘志明,焦新安,趙霞,等.減毒雞沙門氏菌97A疫苗株安全性和免疫效力試驗[J] .中國獸醫(yī)雜志,2001,37(5):12-14.

[12]孫洋,馮書章,劉軍,等.腸出血性大腸桿菌O157:H7基因缺失弱毒疫苗株的研究[J].中國人獸共患病雜志,2006,20(9):765-768.

[13]殷月蘭,朱國強,耿士忠,等.產單核細胞李斯特菌actA/plcB缺失株的構建及其生物學特性[J].微生物學報,2008,48(3):299-303.

[14]SatoshiI,Kazuyoshi K,Yutaka K,etal.Protection against Shiga toxin 1 challenge by immunization of mice with purifiedmutant Shiga toxin 1[J].Infect Immun,2003,71(6):3235-3239.

[15]Talbot UM,Paton JC,Paton AW.Protective immunization of mice with an active-site mutant of subtilase cytotoxin of shiga toxin-producingEscherichiacoli[J].Infect Immun,2005,73(7):4432-4436.

[16]王洪斌,李士虎,李信書,等.基于原核表達的副溶血性弧菌類毒素疫苗對海水魚類免疫保護作用[J].生物技術,2011,21(1):33-37.

[17]Zhang DQ,Xia QX,Wang XL,etal.Construction and immunogenicity of DNA vaccines encoding fusion protein of murine complement C3d-p28 and GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vaccine,2011,29(4):629-635.

[18]Gao X,Cai K,Li T,etal.Novel fusion protein protects against adherence and toxicity of enterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7 in mice[J].Vaccine,2011,38(29):6656-6663.

[19]易勇,鄒全明,程建平,等.Stx2B與ItiminC300融合蛋白的構建、表達及免疫保護研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2005,25(3):227-233.

[20]Wen SX,Teel LD,Judge NA,etal.Genetic toxoids of Shiga toxin types 1 and 2 protect mice against homologous but not heterologous toxin challenge[J].Vaccine,2006,24(8):1142- 1148.

[21]Mao ZJ,Liu Y.Expression and immunogenicity analysis of two iron-regulated outer membrane proteins ofvibrioparahaemolyticus[J].Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2007,39(10):763-769.

[22]Gu J,Liu YQ,Yu S,etal.EnterohemorrhagicEscherichiacolitrivalent recombinant vaccine containingEspA,intiminandStx2 induces strong humoral immune response and confers protection in mice[J].Microbes Infect,2009,10(11):835-841.

[23]張雪寒,何孔旺,盧維彩,等.出血性大腸桿菌O157:H7 Stx2B-Tir-StxlB多價融合蛋白表達及免疫原性研究[J].華北農學報,2010,25(4):180-185.

[24]鄭磊,郭養(yǎng)浩,馬振寧,等.副溶血弧菌融合蛋白FlaA-OmpK疫苗的制備及免疫保護作用[J].中國水產科學,2012,19(5):848-853.

[25] Pulendran B,Ahmed R.Immunological mechanisms of vaccination[J].Natu Immunol,2011,12(6):509-517.

[26]姜建波,提金鳳,李志杰.新型疫苗研究概況[J].動物醫(yī)學進展,2007,28(1):96-100.

[27]Liu R,Chen JX,Li KS,etal.Identification and evaluation as a DNA vaccine candidate of a virulence-associated serine protease from a pathogenicVibrioparahaemolyticusisolate[J].Fish Shellfish Immunol,2011(30):1241-1248.

[28]Li L,Lin SL,Deng L，etal.Potential use of chitosan nanoparticles for oral delivery of DNA vaccine in black seabream Acanthopagrus schlegelii Bleeker to protect fromVibrioparahaemolyticus[J].J Fish Dis，2013,36:987-995.

[29]Ren WK,Yu R,Liu G,etal.DNA vaccine encoding the major virulence factors of Shiga toxin type 2e(Stx2e)-expressingEscherichiacoliinduces protection in mice[J].Vaccine,2013,2(31):367-372.

[30] Liang HY,Wu ZH,Jian JC,etal.Protection of red snapper(Lutjanussanguineus)againstVibrioalginolyticuswith a DNA vaccine containing flagellin flaA gene[J].Lett Appl Microbiol,2011,52:156-161.

[31 ]劉瑞,趙明君,陳吉祥,等.副溶血弧菌tdh2基因和鰻弧菌ompU基因二聯(lián)DNA疫苗制備及其對大菱鲆免疫保護作用[J].海洋與胡泊,2011,42(4):580-586.

[收稿2014-09-25修回2014-10-10]

(編輯許四平)

歡迎訂閱和投稿《中國免疫學雜志》