大鼠肝纖維化實驗動物模型的建立方法*

那 坤，武 亮，李 瀅，鄭 瑩，謝晶日

(1．北京小湯山醫(yī)院，北京 102211;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

大鼠肝纖維化實驗動物模型的建立方法*

那 坤1，武 亮1，李 瀅1，鄭 瑩1，謝晶日2

(1．北京小湯山醫(yī)院，北京 102211;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040)

以往文獻(xiàn)報道肝纖維化動物模型的造模方法造模周期長、動物死亡率高、造模成功率低，在參考以往造模方法的基礎(chǔ)上，對原有造模方法加以改進(jìn)并得到很好的造模效果，希望能為以后肝纖維化動物模型的制備提供新的思路和方法。

肝纖維化;動物模型;方法探析

1 中醫(yī)藥學(xué)對肝纖維化的理解和認(rèn)識

從中醫(yī)藥的古典和書籍中找不到對肝纖維化的記錄和描述，肝纖維化是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理形態(tài)學(xué)概念，在臨床中以脅下積塊、脅部脹痛、黃疸等為主要臨床表現(xiàn)。在中醫(yī)文獻(xiàn)中“瘕積”、“脅痛”、“瘀血”、“積聚”、“臌脹”等病證的臨床表現(xiàn)與肝纖維化的臨床表現(xiàn)相符合。同時因病變積聚于肝，病情反復(fù)纏綿難愈，故被醫(yī)家稱之為“肝著”、“肝積”之病。

中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，本病病因復(fù)雜，病機(jī)變化較多。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為［1］濕熱疫毒是本病最為常見的病因，濕、熱、毒、瘀、虛為本病的病理因素。本病發(fā)病的關(guān)鍵在于機(jī)體正氣的弱與強(qiáng)，根據(jù)正氣的強(qiáng)弱程度不同，會有各種不同的臨床表現(xiàn)，對本病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸都有不同的影響。正氣存內(nèi)，祛邪外出，可以很快恢復(fù)且無后顧之憂。但多數(shù)病人由于疫毒侵襲、致病力強(qiáng)、正氣不充或稟賦不足、邪正交爭，進(jìn)而導(dǎo)致邪勝正衰，肝脾腎諸臟俱受累。濕熱之邪，性本黏滯，纏綿難愈，氣機(jī)易受阻滯;肝失疏泄，脈絡(luò)受阻，氣滯血瘀，血行不暢，而成積聚。氣滯、血瘀、濕積、津傷相互夾雜影響，鼓脹的病因病機(jī)即在于此;同時由于濕熱瘀積、化燥化火、深入心營，進(jìn)而出現(xiàn)生風(fēng)、動血的變化，則多為病情危重難以救治。

2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對肝纖維化發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟中膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的增生和降解之間失去動態(tài)平衡，從而誘發(fā)肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織開始出現(xiàn)異常沉積，最終導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，輕等程度稱為肝纖維化，重等程度使肝小葉結(jié)構(gòu)重建、結(jié)節(jié)和假小葉形成，稱為肝硬化［2-3］，是由肝炎病毒、血吸蟲、藥物與毒物、代謝和遺傳、酒精、膽汁瘀積、自身免疫性肝病等不同損傷因素較長時間慢性刺激肝臟引起炎癥所形成的。由于難以根治和危害面廣，而與癌癥、艾滋病并稱“世紀(jì)三大頑癥”。美國著名肝病學(xué)家 Hans Popper曾指出:“誰能阻止或延緩肝纖維化的發(fā)生，誰將治愈大多數(shù)慢性肝病。”“肝炎→肝纖維化→肝硬化“組成的“三步曲”是各種慢性肝病導(dǎo)致嚴(yán)重后果的共同途徑。由于肝硬化是肝臟實質(zhì)性病變較難逆轉(zhuǎn)，而對于各種肝炎的治愈率不理想且費用昂貴，因此國內(nèi)外學(xué)者不約而同地把目光轉(zhuǎn)向“三步曲”的中間環(huán)節(jié)——肝纖維化。

最近10多年來，肝纖維化的研究在以下方面取得較大進(jìn)展［4］:正常肝臟和纖維化肝臟ECM的各種主要類別、成分、分子結(jié)構(gòu)、組織分布及其功能作用;ECM的細(xì)胞外降解及其調(diào)節(jié)，主要是基質(zhì)蛋白酶及其抑制物的發(fā)現(xiàn);HSC在肝纖維化進(jìn)程中的核心作用;HSC的活化機(jī)制;膠原合成各環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)機(jī)制;肝纖維化發(fā)生時的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，其細(xì)胞來源、作用方式及其信號傳導(dǎo)途徑;肝纖維化的非創(chuàng)傷性診斷模型;肝竇毛細(xì)血管化作為肝纖維化基本特征的新認(rèn)識;建立完善的肝臟實質(zhì)細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)技術(shù);肝纖維化的中醫(yī)藥以及現(xiàn)代生物醫(yī)藥臨床治療。肝纖維化的發(fā)生機(jī)制是一個極為復(fù)雜的病理過程，涉及到組織病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、細(xì)胞因子及其基因水平的調(diào)節(jié)。簡而言之，主要是由各種致病因子導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，如轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、庫普弗細(xì)胞(KC)、血小板衍化生長因子(PDGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)等一些細(xì)胞因子。與此同時，細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失常，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化因子的過度表達(dá)，起到抑制作用的細(xì)胞因子表達(dá)程度低下，從而使膠原降解不足，進(jìn)而在肝臟內(nèi)大量沉積，導(dǎo)致肝纖維化的形成。在肝纖維化形成過程中，會涉及到很多種細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的相互作用，其中以TGF-β1和HSC尤為重要，二者在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展和維持階段中起主要作用，最終導(dǎo)致的結(jié)果是ECM合成增加，降解減少。

建立成功的肝纖維化動物模型，是開展肝纖維化基礎(chǔ)實驗研究必不可少的重要條件之一。目前，建立肝纖維化實驗動物模型的方法有很多種［5］，主要有化學(xué)性、酒精性、病毒性、免疫性、寄生蟲性、營養(yǎng)性、膽汁性、放射性、復(fù)合因素性肝纖維化動物模型等。其中化學(xué)性肝纖維化實驗動物模型較多應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)是四氯化碳(CCL4)和二甲基亞硝胺(DMN)。用CCL4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型是一種經(jīng)典的造模方法，其作用機(jī)制主要是通過細(xì)胞色素P450將CCL4分解為CCL4自由基團(tuán)，從而引起肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，與此同時小葉中央?yún)^(qū)的肝細(xì)胞被選擇性的破壞。在肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，肝微粒體內(nèi)通過細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶的活化之后，CCL4合成具有活性的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，二者會與肝細(xì)胞內(nèi)的大分子產(chǎn)生結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和活性氧自由基的產(chǎn)生，促使肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，進(jìn)而引起狄氏間隙內(nèi)靜止的HSC發(fā)生活化反應(yīng)，從而釋放出Ⅳ型膠原酶來降解Ⅳ型膠原。與此同時，HSC停止分泌Ⅲ型膠原，而開始合成分泌I型膠原，替代Ⅳ型膠原，從而加速肝纖維化的形成。

3 常用的造模方法

通過CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化實驗動物模型造模方法簡便且成功率高，將CCL4溶于橄欖油、甘油、花生油之中，可經(jīng)腹腔注射、皮下注射或灌胃等一些方法進(jìn)行造模。本動物模型的優(yōu)點在于，在實驗早期就能夠見到明顯的肝細(xì)胞損傷情況和炎癥反應(yīng)變化，到實驗的第6～9周時就能夠見到比較明顯的肝臟纖維組織的增生［6］。CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型在形態(tài)學(xué)和病理生理學(xué)的很多方面都與人的肝纖維化病變尤為相似。如兩者都存在肝細(xì)胞壞死后再次生長的這個過程，在肝硬化晚期纖維浸潤是不能夠逆轉(zhuǎn)的，實驗動物表現(xiàn)出的肝功能異常和體征與人的慢性肝病發(fā)展為肝硬化的過程極為相似。因此，CCL4誘導(dǎo)肝纖維化的方法被普遍應(yīng)用在研究肝纖維化發(fā)生機(jī)制以及與組織病理的相關(guān)性和血清學(xué)標(biāo)志物，或者抗肝纖維化藥物的療效評價中。但該動物模型制造方法也有動物死亡率相對較高的缺點，在停止給予造模藥物后，有些動物會有一定自然恢復(fù)的趨勢。但單一因素造模方法造模周期較長、動物模型成功的比例較低，因此目前很多學(xué)者都運用CCL4復(fù)合因素制備肝纖維化動物模型。此種造模方法造出的模型質(zhì)量高，同時動物模型成功的時間較短，肝纖維化進(jìn)展穩(wěn)定，比較適用于以造成肝細(xì)胞損傷作為初始機(jī)制的肝硬化病因病機(jī)發(fā)展過程的動態(tài)研究。韓德五［7］運用復(fù)合因素進(jìn)行造模，給予造模動物低蛋白高脂的飲食，采用玉米面為動物飼料，添加0.5%膽固醇，在實驗開始的前2周在飼料中添加20%豬油，同時采用30%的酒精作為造模動物的惟一飲料，給予每周1次的皮下注射40%CCL4溶劑4ml/kg體質(zhì)量。在實驗進(jìn)行到第6周末即可形成肝硬化模型。此造模方法操作簡單方便，肝纖維化動物模型成功率高達(dá)95%，死亡率低于20%，病變分期明顯，1～2周為肝細(xì)胞變性壞死期，3～4周為肝纖維化壞死期，5～6周為肝硬化期。本造模方法具有敏感性高、重現(xiàn)性好、差異性小等優(yōu)點，在目前肝炎病毒復(fù)制肝纖維化模型尚未成熟的前提下，運用CCL4復(fù)合因素造模是較理想的造模方法之一。

4 經(jīng)過改造的造模方法

國外學(xué)者TaukamotoH等在對肝纖維化動物模型的研究評價中指出［8］，理想的肝纖維化模型應(yīng)與人類疾病所致的肝纖維化形態(tài)和特征相同，可以根據(jù)肝纖維化的類型不同而變動，且其病理學(xué)改變是逐漸形成的。鑒于以上要求，課題組參考閱讀了很多文獻(xiàn)報道，最終選取CCL4復(fù)合因素肝纖維化的動物模型制造方法，其方法操作簡單方便，誘導(dǎo)出的肝纖維化模型在病理生理學(xué)、形態(tài)學(xué)很多方面與人類肝纖維化發(fā)生發(fā)展極為相似，如兩者都有肝細(xì)胞壞死之后的再生過程，動物模型在實驗過程中表現(xiàn)出的肝功能和體征異常與人的慢性肝病發(fā)生發(fā)展為肝硬化過程尤為相似。但在進(jìn)行預(yù)實驗時也發(fā)現(xiàn)幾個問題需要引起我們注意:一是如果完全按照參考文獻(xiàn)報道的用30%酒精作為惟一的飲料飲用，造模大鼠狀態(tài)很差，幾乎每天很少飲水，將酒精濃度降低到10%時，造模大鼠才逐漸恢復(fù)飲水。二是CCL4橄欖油溶液在注射時需要進(jìn)行皮下注射或腹腔內(nèi)注射。我們在實驗中運用皮下注射，在進(jìn)行CCL4橄欖油溶液注射時需將大鼠脊背部位皮膚捏起進(jìn)針，若感覺到有進(jìn)針落空感之后才可以進(jìn)行藥物注射，非正確注射可導(dǎo)致局部范圍皮膚的破潰壞死甚至導(dǎo)致大鼠馬上死亡。三是在建造動物肝纖維化模型早期，需要完全遵照0.35ml/100 g體質(zhì)量的造模給藥劑量進(jìn)行注射，同時還要密切觀察造模大鼠的精神狀態(tài)、活動狀況、行為和皮膚毛色，如果在造模給藥的過程中模型大鼠的體質(zhì)量出現(xiàn)較為明顯的下降，同時伴有皮膚毛發(fā)干枯發(fā)黃、精神萎靡、活動較差，就需要考慮根據(jù)情況減少造模藥物的劑量，否則便會導(dǎo)致造模大鼠的死亡。經(jīng)統(tǒng)計以上造模方法的死亡率約25%，總體比較死亡率低于其他動物的肝纖維化造模方法。最后研究結(jié)果顯示，采用CCL4復(fù)合方法進(jìn)行肝纖維化動物造模制備后，造模大鼠即出現(xiàn)喜睡、精神萎靡、活動量減少、食欲減退、皮毛淺、發(fā)黃干枯、缺少光澤等情況，大約到4周時造模大鼠出現(xiàn)毛發(fā)明顯變黃、色澤黯淡、易激怒、性情急躁、尿液變黃、逐漸消瘦等。有些模型大鼠的脊背部出現(xiàn)包塊和潰瘍，排便出現(xiàn)稀便、肛周污染等癥狀。8周后取材時模型組大鼠出現(xiàn)明顯的肝纖維化表現(xiàn)，肉眼可見模型組大鼠肝臟明顯腫大、邊緣變鈍、質(zhì)地變硬、顏色變淺、包膜變厚、表面粗糙觸有結(jié)節(jié)感，可見細(xì)顆粒狀結(jié)節(jié)呈黃褐色。個別肝小葉與腹腔其他臟器黏連，切面可見黃色脂肪變。HE染色結(jié)果光鏡下可見，大鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈偏離或消失;肝細(xì)胞索排列紊亂，匯管區(qū)擴(kuò)大有大量炎癥細(xì)胞浸潤，中央靜脈區(qū)及肝小葉周邊區(qū)出現(xiàn)肝細(xì)胞大泡性脂肪變性。以上病理改變與肝纖維化的病理改變基本一致，由此可見該模型符合肝纖維化模型標(biāo)準(zhǔn)。

5 小結(jié)

動物模型的成功建立是動物實驗成功的前提和基礎(chǔ)，我們建立各種動物模型的方法大多是參考以往的文獻(xiàn)，并嚴(yán)格按照以往文獻(xiàn)的造模方法建立動物模型，有時可能不會建成符合我們要求的動物模型，這樣我們就需要在以往造模方法的基礎(chǔ)上探索和研究并加以改進(jìn)。以上為筆者在建立肝纖維化大鼠動物模型時的一點摸索和心得，希望能對以后的肝纖維化動物模型的建立方法提供一些新思路和新方法。

［1］ 高峰，程留芳．中醫(yī)藥抗肝纖維化作用機(jī)制的研究［J］．現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，14(5):395-398．

［2］ Atzori L，Poli G，Perra A．Hepatic stellate cell:a starcell in the liver［J］．Int J Biochem Cell Biol，2009，41(8-9):1639-1642．

［3］ Geng J，Peng W，Huang Y，et al．Ginsenoside-Rg1 fromPanax notoginseng prevents hepatic fibrosis induced bythioacetamide in rats［J］．Eur J Pharmacol，2010，634(1-3):162-169．

［4］ 張莎莎，呂文良，張旭，等．肝纖維化的治療研究進(jìn)展［J］．浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，36(4):472-474

［5］ 黃迪，古維立，胡志文，等．大鼠肝纖維模型建立及肝纖維化的檢測［J］．廣州醫(yī)藥，2012，43(5):

［6］ 張磊，李俊，朱鵬里，等．四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化進(jìn)展期和恢復(fù)期模型的建立［J］．中國藥理學(xué)通報，2011，27(12): 1757-1760．

［7］ 韓德五，馬學(xué)惠，趙元昌．肝硬化動物模型的研究［J］．山西醫(yī)藥雜志，1979，8(4):1．

［8］ Benyon RC，Iredaie JP．Is liver fibrosis reversible?［J］．Gut，2005，46(3):443-446．

國家級名老中醫(yī)孫樹椿在北京收徒

本刊訊 2015年3月13日下午，中國中醫(yī)科學(xué)院首席研究員、國家級名老中醫(yī)孫樹椿教授收徒儀式暨首屆北京市復(fù)合型中醫(yī)藥學(xué)術(shù)帶頭人研修班學(xué)員賈育松拜師儀式在北京舉行。北京市中醫(yī)管理局局長屠志濤，第二屆國醫(yī)大師、中日友好醫(yī)院內(nèi)科首席專家晁恩祥，中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院院長朱立國、黨委書記程愛華，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院院長王耀獻(xiàn)、副院長高穎，北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院副院長王慶甫，骨科知名專家孫呈祥、方建國、劉長信等40余人出席會議。中國工程院王永炎院士為拜師儀式發(fā)來賀信。

孫樹椿教授從醫(yī)50余載，他早年師從骨傷科名醫(yī)劉壽山先生，盡得清上駟院綽班處(綽班為滿語意為正骨醫(yī)生)骨傷科醫(yī)道真?zhèn)?，領(lǐng)悟了“機(jī)觸于外、巧生于內(nèi)、手隨心轉(zhuǎn)、法從手出”的正骨推拿要旨后博采大江南北諸家名醫(yī)之長，結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗，形成了“入其法而又出其法”的獨特手技，進(jìn)而發(fā)展成獨具特色的孫氏筋傷學(xué)術(shù)和筋傷疾病的特色手法，成為首批國家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳承人，是骨傷領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物。賈育松主任醫(yī)師出生于中醫(yī)世家，北京中醫(yī)藥大學(xué)博士后，東直門醫(yī)院骨科主任，一直從事中醫(yī)骨傷臨床和科研工作，是中醫(yī)骨傷科界的后起之秀。這次孫樹椿與賈育松結(jié)成師徒關(guān)系，有益于弘揚中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，推動中醫(yī)骨傷科學(xué)術(shù)傳承及創(chuàng)新，加速復(fù)合型中醫(yī)藥人才的培養(yǎng)，促進(jìn)中醫(yī)藥學(xué)術(shù)文明的發(fā)展。

在拜師儀式上，高穎福院長向?qū)O樹椿頒發(fā)了聘書。賈育松按照傳統(tǒng)禮儀遞交了拜師貼并獻(xiàn)茶、獻(xiàn)花。孫樹椿回贈了兩部骨傷著作，寓意了薪火傳承的美好期望。

屠志濤局長在講話指出，首先，孫樹椿教授收徒對促進(jìn)北京市傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，尤其是中醫(yī)骨傷科學(xué)的發(fā)展具有重要意義，是發(fā)揚優(yōu)秀中華傳統(tǒng)文化、中醫(yī)藥學(xué)術(shù)的薪火傳承及培養(yǎng)復(fù)合型中醫(yī)藥人才培養(yǎng)的一個重要舉措。其次，孫樹椿名醫(yī)傳承工作站做了很多工作，為推動北京地區(qū)中醫(yī)骨傷科發(fā)展做出了貢獻(xiàn)。第三，期望通過我們的努力，為推動并規(guī)范醫(yī)療市場的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。相信通過師徒傳承這一途徑，一定能夠把中醫(yī)藥學(xué)術(shù)發(fā)揚光大，為社會各界提供更高水平的醫(yī)療服務(wù)。

Methods to Establish the Animal Model of Experimental Liver Fibrosis in Rats

NA Kun1，WU Liang1，LI Ying1，ZHENG Ying1，XIE Jing-ri2
(1．Beijing xiaotangshan hospital，Beijing 102211，China; 2．The first hospital affiliated to heilongjiang university of Chinese medicine，Haerbing 150040，China)

In the literature of liver fibrosis animal model building methods，building cycle is long，animals high mortality，on the basis of reference past methods of building，the original building method is improved．We got very good effect on building the animal modeland hope it can provide animal models of liver fibrosis after preparation with new ideas and methods．

Liver fibrosis;Animal models;Methods analysis

R256．42

A

1006-3250(2015)03-0272-03

2014-10-25

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項目

那 坤(1980-)，男(滿族)，黑龍江鶴崗人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，醫(yī)學(xué)博士后，從事中西醫(yī)結(jié)合預(yù)防和治療消化系統(tǒng)疾病的臨床與研究。