補腎膏等院內(nèi)膏方微生物限度檢查方法的建立

郭紅玲

長沙市中醫(yī)醫(yī)院（長沙市第八醫(yī)院），湖南 長沙 410001

補腎膏等院內(nèi)膏方微生物限度檢查方法的建立

郭紅玲

長沙市中醫(yī)醫(yī)院（長沙市第八醫(yī)院），湖南 長沙 410001

目的：建立我院膏方微生物限度檢查方法。方法：根據(jù)2010版 《中國藥典》規(guī)定，對我院補肺膏等10個基礎膏方進行微生物限度檢查方法的驗證。結果：補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽培補膏等4種膏方具有一定的抑菌作用，其余6種膏方無抑菌作用。結論：補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽培補膏4種膏方采用培養(yǎng)基稀釋法檢查其微生物限度；補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、兒童健脾開胃膏、培元固衛(wèi)膏6種基礎膏方用常規(guī)平皿法檢查微生物限度。

膏方；微生物限度；方法建立

膏方又稱 “膏滋”或 “煎膏”，是最古老的劑型之一［1］，多具有滋補，預防與治療作用，特別是對于亞健康與體弱多病者的調養(yǎng)效果顯著。隨著生活水平的不斷提高，人們對健康意識不斷增強，中醫(yī)藥養(yǎng)生知識的大量普及［2］，使膏方在各地區(qū)也越來越得到大眾的認可。

目前，各醫(yī)院制作的膏方無統(tǒng)一質量控制標準，且文獻對膏方質量控制的報道不多，特別是微生物方面的文獻更少［3］。然而，醫(yī)院膏方的制作多采用手工傳統(tǒng)制作方法，容易受操作器具、原輔料及環(huán)境微生物污染，有必要對醫(yī)院制作的基礎膏方建立相應的微生物限度檢驗方法，以確保衛(wèi)生學的安全性。根據(jù)2010版 《中國藥典》附錄的規(guī)定，在藥品進行檢驗前必須進行方法學驗證。故本實驗室根據(jù)2010版 《中國藥典》一部附錄要求，查閱相關文獻［4－7］，對我院補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏等10種基礎膏方進行微生物限度檢測方法摸索，建立了我院基礎膏方微生物限度檢驗方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 立式壓力蒸汽滅菌器 （湖南衡陽金一帆制藥設備實業(yè)有限公司）；XPX－150型生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；MJ－160－Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱 （武漢武昌實驗儀器廠）；紫外儀 （上海安亭電子儀器廠）。

1.2 材料

1.2.1 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌［CMCC（B）22102］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉菌［CMCC（F）9003］，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2.2 培養(yǎng)基 膽鹽乳糖增菌液（批號：120627）、玫瑰紅鈉瓊脂（批號：120522）、營養(yǎng)瓊脂（批號120423）、營養(yǎng)肉湯（批號：121205）為北京三藥科技開發(fā)公司產(chǎn)品；改良馬丁 （批號：120215）、改良馬丁瓊脂 （批號：121025）為杭州微生物試劑公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 菌液的制備 按照2010版《中國藥典》一部附錄ⅫⅠ［7］要求制備。

2.2 供試液的制備 取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀混勻，制成1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證方法 （平皿法）

2.3.1 試驗組 取“2.1”項下菌液1m l和“2.2”項下1：10供試液1ml，注入同一直徑為90mm的平皿中，立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，平行制備2個平皿。

2.3.2 菌液組 分別取“2.1”中的每一種試驗菌加入培養(yǎng)皿中，注入45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定菌液菌落數(shù)。將以上制備的培養(yǎng)皿，細菌置于30～35℃培養(yǎng)48小時；霉菌置于25℃培養(yǎng)72h，每日觀察測定菌液菌落數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 取“2.2”項下1∶10供試液1m l，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20m l，測定供試品本底菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取“2.1”項下菌液1m l和“2.2”項下稀釋劑1ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，測定其菌落數(shù)。

2.4 培養(yǎng)基稀釋法

2.4.1 試驗組 取“2.2”項下1∶10的供試液的供試液2ml，每1m l供試液分別等量注入5個平皿中，每10個皿為一組。取“2.1”項下金黃色葡萄球菌菌液1m l，分別注入上述培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20m l，置于30～35℃培養(yǎng)48h，測定其菌落數(shù)。

2.4.2 菌液組 取“2.1”項下金黃色葡萄球菌試驗菌液1ml加入培養(yǎng)皿中，注入45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定菌液菌落數(shù)。將以上制備的培養(yǎng)皿，細菌置于30～35℃培養(yǎng)48h，每日觀察測定菌液菌落數(shù)。

2.4.3 供試品對照組 取“2.2”項下1∶10供試液0.2ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20m l，測定供試品本底菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取“2.1”項下菌液1ml和“2.2”項下稀釋劑0.2ml，注入培養(yǎng)皿中，立即傾注45°營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，測定其菌落數(shù)。

2.5 控制菌檢查方法驗證

2.5.1 供試液制備 同“2.2”項下供試液制備。

2.5.1.1 試驗組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項下制備的大腸桿菌陽性菌液1ml注入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃，培養(yǎng)18～24h后，取該培養(yǎng)物0.2m l，接種至5mlMUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，分別于5h、24h置366nm紫外光下觀察有熒光反應，沿試管壁加入數(shù)滴靛基質試液，液面呈玫瑰紅色。

2.5.1.2 陰性對照組 取1∶10供試液10ml與“2.1”項下制備的金黃色葡萄球菌陽性菌液1ml注入100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，置于35℃，培養(yǎng)18～24h后，取該培養(yǎng)物0.2ml，接種至5m lMUG培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，分別于5、24h置366nm紫外光下觀察無熒光反應，沿試管壁加入數(shù)滴靛基質試液，液面呈本色，結果為陰性。

2.5.2 大腸菌群檢查方法驗證

2.5.2.1 供試液制備 取1∶10的溫陽培補膏供試液采用逐級稀釋法，稀釋為1∶100，1∶1000的供試液。

2.5.2.2 試驗組 分別取“2.5.2.1”項下1∶10，1∶100，1∶1000的供試液各1ml，分別加入10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，并分別加入 “2.1”項下制備的大腸桿菌陽性菌液1m l，培養(yǎng)18～24h，觀察結果。

2.5.2.3 陰性對照試驗 取稀釋液1ml加入10ml乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時，觀察結果，結果為陰性。2.5.2.4 供試品檢查 分別取“2.5.2.1”項下1∶10，1∶100，1∶1000的供試液各1ml，分別加入10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中，按2010版 《中國藥典》一部附錄要求操作，觀察結果。

3 結果

3.1 菌數(shù)回收率的計算

《中國藥典》2010版規(guī)定各試驗菌株的回收率（%）均得大于70%。

3.2 常規(guī)平皿法驗證結果 用常規(guī)平皿法對10種膏方的細菌、霉菌與酵母菌計數(shù)的驗證，結果見表1。由表1可知，補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、糖尿病膏、溫陽培補膏四種基礎膏方用常規(guī)平皿法測定其枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率在70%以下，說明該四種基礎膏方對草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強；改用培養(yǎng)基稀釋法測定，其結果見表2，但白色念珠菌、大腸埃希菌及黑曲霉菌回收率均在70%以上，說明其對這3種菌無抑菌作用，可以用常規(guī)平皿法測定這三種膏方的霉菌與酵母菌。補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、兒童健脾開胃膏、培元固衛(wèi)膏6種基礎膏方用常規(guī)平皿法測定其細菌與霉菌及酵母菌計數(shù)驗證回收率均在70%以上，說明可以用常規(guī)平皿法對補腎膏、三仙滋補膏、益智安神膏、滋陰潤燥膏、培元固衛(wèi)膏、兒童健脾開胃膏進行細菌與霉菌及酵母菌的微生物限度測定。

3.3 培養(yǎng)基稀釋法驗證結果 用培養(yǎng)基稀釋法對補肺膏等4種基礎膏方的霉菌及酵母菌計數(shù)測定法進行驗證。有表2可知，枯草胞桿菌及金黃色葡萄球菌回收率均在70%以上，說明培養(yǎng)基稀釋法可以用于補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏和糖尿病膏的微生物限度測定。

3.4 控制菌檢查方法驗證結果 采用2010版《中國藥典》一部附錄方法對10種膏方的控制菌檢查方法進行驗證，結果均符合要求，結果表明可以采用常規(guī)法，對我院各膏方進行控制菌微生物限度檢查。

4 討論

中藥膏方是自古以來就有的傳統(tǒng)中藥劑型之一，不僅是單純的補藥，兼有治療和預防，即 “祛病糾偏”的雙重療效，集補、調、療的綜合功效［8、9］，在養(yǎng)生、慢性疾病及治未病方面起到良好的療效。隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快，亞健康人群的不斷壯大及養(yǎng)生觀念的不斷加強，冬令膏方在我國越來越受到重視，但關于其質量控制的文獻報道較少，特別是微生物限度測定的更少。因膏方含藥味多，處方量大，在制作過程中可能會受到微生物污染，為了保證其安全，根據(jù)2010版《中國藥典》的要求，對我院自制的10種基礎膏方進行微生物限度測定的方法學驗證，建立了我院基礎膏方微生物限度測定的方法。

通過驗證試驗發(fā)現(xiàn)，含有清熱解毒類、化痰止咳類中藥材的膏方，因部分藥材本身具有較強的抑菌作用，其加工制備后仍具有一定的抑菌作用。常規(guī)平皿法不能直接用于該類膏方的微生物限度測定，而選用培養(yǎng)基稀釋法測定。通過驗證，我院基礎膏方的霉菌與酵母菌檢查法基本都可以采用常規(guī)法測定。補肺膏、養(yǎng)顏調經(jīng)膏、溫陽培補膏、糖尿病膏等膏方的細菌檢查法需采用培養(yǎng)基稀釋法測定?？刂凭鷻z查都可以采用2010版《中國藥典》規(guī)定的常規(guī)法進行。

通過對膏方微生物限度的測定方法的驗證，制定合適的膏方微生物限度測定方法，確保膏方在制作的過程中不被微生物污染，避免膏方在患者服藥的長期貯存中霉變而變質，保證患者用藥的安全性，為膏方質量控制的制定提供一定的基礎。

［1］胡冬裴.論中醫(yī)膏方之源流［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2003，12（4）：9－10.

［2］史紅霞，屠亞軍.膏方在現(xiàn)代臨床中的應用 ［J］.中國社區(qū)醫(yī)師.醫(yī)學專業(yè)，2012，13（14）：33.

［3］陳國寶.膏滋藥質量控制探析［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2012.7（7）：681－684.

［4］黃文嫻，金國良.5種醫(yī)院制劑微生物限度及其質量考察 ［J］.抗感染藥學，2011，9（3））：198－200.

［5］柳冬梅.當歸養(yǎng)血膏微生物限度檢查法驗證 ［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25（22）：3379－3381.

［6］姚華，潘庭峰.食品、藥品微生物檢驗用培養(yǎng)基的比較 ［J］.淮海醫(yī)藥，2012，1（1）：73－74.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 （一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社；2010：附錄79－88.

［8］謝崇義，鳳俊蓉.我院中藥膏方配制工藝及臨床應用注意事項 ［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2007，16（29）：4281－4282.

［9］楊志敏，謝東平.顏德馨膏方治療高脂血癥經(jīng)驗 ［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（12）：8－9.

R446.5

A

1007－8517（2015）11－0007－03

2015.04.02）

郭紅玲（1985.11），湖南東安人，碩士研究生，主要從事醫(yī)院制劑研究開發(fā)與檢驗。Tel：0731－85259157。