HPLC法測定肝素鈉原料中EDTA－2Na的殘留

要 輝 紀(jì)萬里 白育庭

湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437000

HPLC法測定肝素鈉原料中EDTA－2Na的殘留

要 輝 紀(jì)萬里 白育庭

湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437000

目的：建立肝素鈉原料中EDTA－2Na的殘留測定方法。方法：色譜柱：WondaSil－C18（200mm×4.6mm×5μm）；流動相：pH為3.0的0.025mol／l硫酸銨溶液；檢測波長：254nm；檢測溫度：室溫；流速：1.0ml／min；進樣量：20μl。結(jié)果：EDTA－2Na在0.1～1.5μg／m l濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為100.09%，RSD為1.0%。結(jié)論：本法測定肝素鈉中EDTA－2Na具有良好的專屬性、線性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，適用于EDTA－2Na的檢測。

肝素鈉；EDTA－2Na；殘留測定

肝素鈉是從豬小腸黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道爾頓，臨床常作為注射劑使用。肝素鈉本身帶負電荷，能干擾血凝過程的許多環(huán)節(jié)，其作用機制比較復(fù)雜，主要通過與抗凝血酶Ⅲ （AT－Ⅲ）結(jié)合，而增強后者對活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。具體涉及阻止血小板凝集和破壞，妨礙凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原變?yōu)槟?；抑制凝血酶，從而妨礙纖維蛋白原變成纖維蛋白［1］。肝素鈉作為原料藥，中國藥典中明確規(guī)定了其重金屬限度的檢測，但由于其來源于動物組織提取，實際生產(chǎn)工藝中均要增加去除重金屬的工藝。目前多采用添加EDTA－2Na來螯合重金屬，形成水溶物后，經(jīng)分級沉淀步驟去除螯合物。EDTA－2Na收載于FDA《非活性組分指南》，可用于非注射和注射給藥制劑，會與人體內(nèi)的鈣離子形成螯合物，引起低血鈣等癥狀［2］。由于肝素鈉生產(chǎn)過程中使用EDTA－2Na去除重金屬，所以在終產(chǎn)品中可能殘留EDTA－2Na，對其進行檢測有重要的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TG332A型分析天平（湘儀天平儀器設(shè)備有限公司）；LC－15C型高效液相色譜儀（日本島津）；LC－20AD型紫外檢測器（日本島津）；

1.2 材料 硫酸銅（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；EDTA－2Na（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；肝素鈉（注射級，批號：HM120401、HM120402、HM120403，石家莊市協(xié)和藥業(yè)有限公司）。水為自制純化水 （二級反滲透法）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠填料WondaSil-C18（200mm×4.6mm×5μm）；流動相：0.025mol／l硫酸銅溶液［3］（用稀硫酸調(diào)節(jié)pH至3.0）；檢測波長：254nm；流速：1.0ml／min；檢測溫度：室溫；進樣量：20μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液的制備 精密量取0.04mol／l硫酸銅溶液1.0ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品未絡(luò)合溶液的制備 精密稱取EDTA－2Na 10mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品未絡(luò)合溶液的制備 精密稱取供試品100mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 對照品溶液的制備 精密量取1.0m l對照品未絡(luò)合溶液，置100m l量瓶中，再精密加入0.04 mol／l硫酸銅溶液1.0ml，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取供試品100mg，置100ml量瓶中，再精密加入0.04 mol／l硫酸銅溶液1.0ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 按照2010年版《中國藥典》二部附錄VD高效液相色譜法［4］，檢測波長254nm，分別精密量取空白溶液、供試品溶液、對照品溶液、對照品未絡(luò)合液、供試品未絡(luò)合液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在此色譜條件下，EDTA－2Na經(jīng)硫酸銅絡(luò)合后在254nm處有吸收，硫酸銅與EDTA－2Na峰可完全分離，分離度大于1.5，主峰峰形較好，理論塔板數(shù)大于2000，并且單獨的硫酸銅、EDTA－2Na、肝素鈉均不干擾測定因此，本方法系統(tǒng)適用性、專屬性良好。

2.4 流動相溶液pH值考察 采用不同pH進行EDTA－2Na檢查，精密量取對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，考察pH值對本品EDTA－2Na的影響。由表1可知，pH值對對照品的峰面積無影響，且不同pH值條件下的理論塔板數(shù)均大于2000，具有良好的系統(tǒng)適用性。

2.5 線性考察 分別精密量取對照品溶液0.1、0.5、1.0、1.25、1.5ml置100m l量瓶中，精密加入0.04mol／l硫酸銅溶液1.0ml，加水稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1ml溶液中含0.1、0.5、1.0、1.25、1.5μg的對照品溶液，分別精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。得線性方程為：y＝10593.8043x－329.8098，r＝0.9999。結(jié)果表明，EDTA－2Na在0.1～1.5μg／ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度實驗 平行配制對照品溶液6份，按照上述色譜條件進針測定樣品中EDTA－2Na的含量，RSD為0.26%。說明儀器的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，平行制備6份，同法測定，結(jié)果RSD為0.42%，重現(xiàn)性較好，符合驗證方案的要求。

2.8 穩(wěn)定性實驗 對照品溶液和供試品溶液置室溫放置，分別于0、1、2、3、4h測定。結(jié)果表明樣品溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率實驗 為確定本測定方法的準(zhǔn)確度，進行了加樣回收率試驗。EDTA－2Na貯備液的制備：精密稱取10mg EDTA－2Na，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。120%回收率溶液的制備：精密稱取供試品50mg，置50ml量瓶中，精密加入EDTA貯備液1.2ml，精密加入0.04 mol／l硫酸銅溶液1.0ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法分別吸取貯備液1.0ml及0.8ml配制100%回收率溶液和80%回收率溶液。分別精密量取以上溶液各20μl注入液相色譜儀，計算回收率。由表2可知，該方法測定回收率其平均回收率為100.09%，RSD為1.0%，表明本方法用于EDTA－2Na測定具有較好的準(zhǔn)確度。

2.10 檢測限及定量限 取對照品溶液，加水不斷稀釋至適宜濃度，以信噪比為3∶1時的濃度確定檢測限，測得為0.05μg／ml；以信噪比為10∶1時的濃度確定定量限，測得為0.1μg／ml。

2.11 樣品測定 按照上述所確定的色譜方法檢測批號為HM120401、HM120402、HM120403中的EDTA－2Na殘留量，三批樣品分別為0.01%，0.01%，0.00%。

3 討論

EDTA－2Na的檢測方法較多，常用的有滴定法和比色法，但這些方法的選擇性不高，專屬性不好。本研究選用專屬性較好的HPLC法來測定，回收率較好，準(zhǔn)確度高，符合驗證方法的要求。另外，銅離子可與EDTA－2Na形成較為穩(wěn)定的螯合物［5］，保證了室溫放置4h其性質(zhì)不變。綜上所述，HPLC法檢測EDTA－2Na的殘留具有很好的靈敏度，準(zhǔn)確度，簡單方便。

［1］于廣利，趙峽.糖藥物學(xué)［M］.青島：中國海洋大學(xué)出版社，2012：315－320.

［2］鄭俊民.藥用輔料手冊［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：263.

［3］Lon HALL，L loyd Takahash.determination of disodium edetate in ophthalmic and contact lens care solutions by reversed phase hight performance liquid chromatography［J］.JPharm S ci，1988，77（3）：247.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄VD.

［5］羅祎，趙永彪，李淑娟，等.反相高效液相色譜法測定食品中EDTA的含量［J］.中國食品添加劑，2006，17（4）：156.

Determination of residues of EDTA－2Na in raw heparin sodium by HPLC

YAO Hui*JIWan Li BAIYu ting
HuBei University Of Science And Technology School of Pharmacy，HuBei province，Xian ning437000，China

ObjectiveTo establish themethod for determination of the residues of EDTA－2Na in raw heparin sodium.MethodThe chromatographic column isWondaSil－C18（200mm×4.6mm×5μm）；mobile phase0.025mol／l ammonium sulfate（pH 3.0）；the column temperature is room temperature；detection wavelength is254nm；the flow rate is1.0ml·min－1；the amountof injection is 20ul.ResultsThe chromatographicmethod to detect the use of heparin raw material in EDTA－2Na is accurate，and the calibration curve of disodium edetate is linear in the range of0.1～1.5μg／ml.the average recoverywas100.09%，RSD was1.0%.ConclusionThemethod is accurate，reproducible which can be used for the residues of EDTA－2Na in raw heparin sodium.

heparin sodium；EDTA－2Na；residues

R943

A

1007－8517（2015）16－0028－02

2015.05.15）

要輝（1983－），藥學(xué)碩士研究生，主要從事新藥研發(fā)及分析。E－mail：yaohui003＠hotmail.com