ELISA在植物檢疫中的應(yīng)用及其質(zhì)量控制

梁新苗 邊勇 汪萬春 李建光 張偉魏 海燕 劉來福

（北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026）

ELISA在植物檢疫中的應(yīng)用及其質(zhì)量控制

梁新苗 邊勇 汪萬春 李建光 張偉魏 海燕 劉來福*

（北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026）

介紹了ELISA技術(shù)在植物病毒、真菌、細(xì)菌檢測上的應(yīng)用及進(jìn)展，并對其質(zhì)量控制進(jìn)行了討論。

ELISA；植物檢疫；質(zhì)量控制

1 前言

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是一種常見的抗原抗體檢測技術(shù)，它把抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來，用于檢測包被于固相板孔中的待測抗原（或抗體），是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。本文對ELISA的反應(yīng)類型及其在植物檢疫中的應(yīng)用進(jìn)行了概述，并對ELISA用于植物檢疫質(zhì)量控制過程中樣品的處理、試劑的穩(wěn)定性、交叉反應(yīng)及技術(shù)操作等注意事項進(jìn)行了梳理，對存在的問題進(jìn)行了討論，以期進(jìn)一步規(guī)范ELISA用于植物檢疫中的應(yīng)用。

2 ELISA在植物檢疫中的應(yīng)用

ELISA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單等優(yōu)點，克服了常規(guī)血清學(xué)方法受病毒濃度、粒子形態(tài)和抗血清用量等因素的限制，目前在植物檢疫中得到了廣泛的應(yīng)用。

2.1ELISA在植物病毒檢測上的應(yīng)用

2.1.1檢測植物病毒抗原

1976年，Voller等［1］將ELISA技術(shù)應(yīng)用于蘋果花葉病毒（Apple Mosaic Virus，ApMV）的檢測，Clark等［2］將ELISA技術(shù)應(yīng)用于南芥菜花葉病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和李痘病毒（Plum Pox Virus，PPV）的檢測，標(biāo)志著ELISA技術(shù)正式應(yīng)用到植物病毒。

馬鈴薯卷葉病毒（Potato Leaf Roll Virus，PLRV）在植物中的含量很低，很難用其他血清學(xué)方法對其植株粗汁液當(dāng)中的病毒進(jìn)行檢測。Casper的研究表明，ELISA技術(shù)可以用于檢測PLRV，同時還可以定量分析該病毒在寄主植物不同器官中的分布及相對濃度。

ELISA技術(shù)還可以用于檢測單粒種子中的病毒。目前在煙草環(huán)斑病毒（Tobacco Ringspot Virus，TRSV）、大麥條紋花葉病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）、大豆花葉病毒（Soybean Mosaic Virus，SMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber Mosaic Virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus，CGMMV）等的單粒種子檢測上均得到很好效果。

Bossennec［3］在對SMV的研究中發(fā)現(xiàn)，ELISA技術(shù)還可用于測定單粒種子不同部位帶毒情況。將大豆種子的不同部位用解剖刀分成大豆胚芽、胚根、胚乳、種皮等，每個部位分別進(jìn)行處理后進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明在不同部位均可檢測到SMV。種子各部分抗原最高稀釋500-2000倍仍可檢測出其中的病毒。

目前，很多種植物病毒在不同方面、不同程度上都可以成功地進(jìn)行ELISA試驗，張成良等［4］分析了已報道的50種植物病毒應(yīng)用ELISA診斷的研究資料，表明ELISA技術(shù)的使用范圍很廣，可以覆蓋國內(nèi)外已報道的所有病毒形態(tài)的病毒，如球狀、線狀、桿狀、彈狀和桿菌狀、分枝絲狀體等，并且受實驗材料的限制性較小，其在植物病毒上的應(yīng)用具有廣闊前景。

2.1.2檢測植物病毒間的親緣關(guān)系

ELISA技術(shù)具有?；詮?qiáng)的優(yōu)點，非常適合于研究植物病毒間的血清學(xué)親緣關(guān)系。Koenig［5］對26個病毒樣品進(jìn)行了同源反應(yīng)和異源反應(yīng)試驗，結(jié)果表明ELISA對植物病毒的株系有高度的選擇性，不僅可以測定不同病毒之間的親緣關(guān)系以及株系關(guān)系，還可以測定親緣關(guān)系很近的病毒的分化。Clark等使用間接ELISA進(jìn)行同源反應(yīng)和異源反應(yīng)試驗，得到抗體反應(yīng)曲線，對植物病毒的血清學(xué)關(guān)系進(jìn)行研究。對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，從而確定不同病毒-抗體組合的親緣關(guān)系。

ELISA技術(shù)還可以對同一病毒的不同血清類型進(jìn)行區(qū)分。Barbara等［6］使用ELISA技術(shù)對酒花及李樹上的李壞死環(huán)斑病毒株系進(jìn)行了快速檢測及血清學(xué)分型；李彥勇［7］應(yīng)用直接ELISA和間接ELISA對來自不同國家和地區(qū)的10個蕪菁花葉病毒（Turnip Mosaic Virus，TuMV）株系或分離物間的血清學(xué)關(guān)系進(jìn)行了比較試驗，結(jié)果表明間接ELISA技術(shù)較直接ELISA技術(shù)更適用于廣譜的病毒診斷及株系鑒定。

2.1.3植物病毒流行病學(xué)分析

利用ELISA對植物病毒的分布情況進(jìn)行追蹤調(diào)查，研究植物病毒變異株系的地域性，對植物流行病學(xué)的研究具有指導(dǎo)意義。李瑛等［8］利用ELISA對蘭州百合病毒進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)蘭州百合病毒含量隨著種植年限的增加而增加；施曼玲等［9］利用三抗體夾心ELISA對蕪菁花葉病毒進(jìn)行了檢測，測定出7種農(nóng)作物上有TuMV感染；趙榮樂等［10］從新疆感病的蘿卜（Raphanus sativus）上分離到一種線狀病毒，染病組織粗汁液和提純病毒制備物在ELISA檢測中與蕪菁花葉病毒抗血清發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，證明該病毒株應(yīng)屬于蕪菁花葉病毒的一個株系；孫清等應(yīng)用間接ELISA對采自河南省中部煙區(qū)的花葉病標(biāo)樣進(jìn)行檢測；譚雪蓮等采用DAS-ELISA檢測方法對甘肅地區(qū)葡萄主要品種進(jìn)行扇葉病毒和卷葉病毒的調(diào)查和測定。

2.1.4檢測介體昆蟲內(nèi)的病毒

昆蟲介體傳播是植物病毒自然傳播的主要途徑，因此對昆蟲介體的準(zhǔn)確、快速檢測對植物病毒的早期診斷、病情預(yù)測預(yù)報和及時采取防治措施具有重要意義。常規(guī)的昆蟲介體帶毒檢測方法步驟繁瑣、檢測數(shù)量有限、實驗周期長且準(zhǔn)確性差，使用ELISA技術(shù)對介體昆蟲進(jìn)行檢測則可克服上述缺點，為定量研究昆蟲介體體內(nèi)的病毒含量及分布提供了可能。

Clarke等使用ELISA技術(shù)不僅檢測了馬鈴薯塊莖中的馬鈴薯卷葉病毒，同時還從攜帶PLRV的桃蚜體內(nèi)檢測到PLRV。豌豆長管蚜是豌豆耳突花葉病毒（Pea Enation Mosaic Virus，PEMV）的傳毒介體，Denis Fargette等［11］使用ELISA技術(shù)對豌豆長管蚜的單個蛹及成蟲進(jìn)行檢測，ELISA技術(shù)檢測PEMV的靈敏度為在5 ng/mL，單頭豌豆長管蚜體內(nèi)含1 ng的PEMV時仍可被檢出。

2.1.5用于樣品的初步篩查

對于大規(guī)模樣品的檢測，可以先使用ELISA方法對樣品進(jìn)行初步篩查，用于區(qū)分陰性和陽性樣品，之后再將ELISA檢測得到的陽性樣品或弱陽性樣品進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)技術(shù)檢測，從而驗證樣品中是否含有待檢病毒。

2.2ELISA在植物細(xì)菌檢測上的應(yīng)用

寧紅等［12］用ELISA技術(shù)進(jìn)行水稻細(xì)菌性條斑病菌的研究，研究表明從制樣到完成檢測約需40 h。檢測結(jié)果不但可以目測定性，還可用酶聯(lián)免疫檢測儀所測得的OD值在試驗制作的曲線上查出稻谷帶菌量。楊蘇聲等［13］用ELISA對大豆根瘤菌的鑒定中，發(fā)現(xiàn)該法能夠特異地檢測和區(qū)別慢生型和快生型大豆根瘤菌；ELISA的最低檢測濃度為2×105細(xì)胞/mL；在冰箱低溫（-20℃）和硅膠干燥常溫條件下保存根瘤，均不影響ELISA的檢測效果，靈敏度不降低。姜榮文等［14］采用ELISA技術(shù)測定了我國根瘤菌株與引進(jìn)菌株NC92的血清型異同和大田接種花生后的結(jié)瘤比率，并比較了限定培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基培養(yǎng)制備的抗原-抗體反應(yīng)。

2.3ELISA在植物真菌檢測上的應(yīng)用

隨著其他新方法的出現(xiàn)，ELISA在真菌檢測領(lǐng)域應(yīng)用的研究逐漸減少。竇坦德等［15］在快速檢測大豆疫霉菌的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)研究中，發(fā)現(xiàn)間接法（I-ELISA）和雙抗夾心法（DAS-ELISA）都能較好地檢測純培養(yǎng)的大豆疫霉菌，但在檢測病組織時，DAS-ELISA的特異性更強(qiáng)，能夠可靠地檢測到大豆病組織內(nèi)的病原菌。馬貴龍等［16］制備了煙草赤星病菌的抗血清，用ELISA間接法對煙草種子進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：制備的抗體球蛋白IgG對來自吉林省內(nèi)5個市縣的8個煙草赤星病菌株全部呈陽性反應(yīng)，而對Alternaria cuucumerina和Alternaria porri則呈陰性反應(yīng)，對種子分離得到的Fusarium sp.和Phyllosticta sp.等4種真菌及煙草野火病菌和Xanthomonas sp.均呈陰性反應(yīng)，表明該抗體球蛋白IgG的特異性很強(qiáng)。對7種不同濃度孢子懸液接種花器所獲種子進(jìn)行檢測，與種子分離培養(yǎng)結(jié)果一致。因此，ELISA法對于檢測煙草種子是否帶有赤星病菌是一種快速而準(zhǔn)確的方法。

3 ELISA的質(zhì)量控制關(guān)鍵點

ELISA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便等特點，并且易于自動化，應(yīng)用非常廣泛。但由于ELISA在應(yīng)用過程中還存在很多難點，因此必須進(jìn)行質(zhì)量控制才能保證其檢測結(jié)果準(zhǔn)確。ELISA質(zhì)量控制是一個復(fù)雜的過程，有很多影響因素。

3.1人員

進(jìn)行ELISA檢測的人員應(yīng)進(jìn)行培訓(xùn)，對包括ELISA原理、試劑性能、儀器使用、操作規(guī)程等內(nèi)容熟練掌握。

3.2試劑

試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平，因此在引入新項目之前必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格評估。必須選擇和訂購質(zhì)量穩(wěn)定、可靠的試劑，并保證保存條件。例如植物病毒檢測常用的試劑公司來源有AGDIA、ACD和ADI；對于有效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效；試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限；未用完的質(zhì)控樣品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。

3.3樣品

樣品應(yīng)盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中可能含有內(nèi)源酶對測定產(chǎn)生非特異性干擾，還可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。若樣品在保存過程中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清進(jìn)行檢測。樣品的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價跌落從而引起假陰性結(jié)果［17］。標(biāo)本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮造成分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。

3.4操作步驟

ELISA的操作步驟復(fù)雜，主要包括包被、洗板、加樣、溫育、讀板等步驟，現(xiàn)就各步驟的主要影響因素進(jìn)行分析。

3.4.1加樣

必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。加不同的標(biāo)本時需更換槍頭，以免發(fā)生交叉污染。加樣時速度不可太快，避免將樣品加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時還應(yīng)注意操作時差對結(jié)果的影響，操作時差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時間的差異。由于存在邊緣效應(yīng)，避免將樣品加在酶聯(lián)板的邊緣。

3.4.2溫育

抗原抗體反應(yīng)的完成需要一定溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育。植物病毒檢測中常采用的溫育溫度有37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中最常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。植物病毒檢測常用的溫育方式有溫箱法、水浴法等，其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（這種現(xiàn)象被稱為“邊緣效應(yīng)”）。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腅LISA試劑盒一般都規(guī)定了明確的溫育溫度，若要求室溫溫育，則一般是指20℃-25℃。

3.4.3洗滌

ELISA檢測過程中，要進(jìn)行多次洗滌，因此洗滌是一個很重要的操作，通過徹底洗滌，除去未被結(jié)合的抗原、抗體或結(jié)合物，防止它們和隨后加入的相對應(yīng)的抗體、結(jié)合物或者底物等發(fā)生干擾反應(yīng)。洗滌操作要求嚴(yán)格、一致，使每一個反應(yīng)孔都用同樣方法嚴(yán)格清洗。洗滌的方法很多，洗滌液可用生理鹽水或PBS，但一般多在洗液中加入吐溫，以避免非特異性吸附。除了加入吐溫，還可加入牛血清蛋白或白明膠。疊氮化鈉作為一種保護(hù)性阻斷劑，用量應(yīng)適當(dāng)，否則影響反應(yīng)強(qiáng)度。

3.4.4顯色

顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，底物濃度是影響顯色反應(yīng)的最重要的條件之一。在底物濃度不是過高時，反應(yīng)速度與底物的濃度成正比；當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r，反應(yīng)速度趨近最大值，此時，再增加底物濃度反應(yīng)速率不再增加。研究表明，顯色受時間和溫度的影響，一般37℃反應(yīng)30 min可使顯色充分，如果縮短反應(yīng)時間或者降低反應(yīng)溫度均可影響檢測的下限。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須固定顯色時間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點。

4 結(jié)語

ELISA技術(shù)在近幾年高速發(fā)展，已成為21世紀(jì)最具競爭力和挑戰(zhàn)性的檢測分析新技術(shù)之一。ELISA檢測所需儀器化程度低、操作簡便、對樣本預(yù)處理要求簡單、易于推廣，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，并且對環(huán)境無污染，它已成為主要的免疫學(xué)檢測技術(shù)，得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，其應(yīng)用覆蓋范圍也在不斷壯大。在植物檢疫領(lǐng)域，ELISA在檢測植物病毒抗原、檢測病毒間親緣關(guān)系、植物病毒的流行病學(xué)分析、樣品初篩、植物細(xì)菌檢測以及植物真菌檢測等方面均得到廣泛的應(yīng)用。另外，在生態(tài)學(xué)研究中，利用ELISA技術(shù)檢測捕食作用，研究并分析食物關(guān)系，可以幫助更好地理解和預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)的一些基本過程，更好地了解相互作用的多物種系統(tǒng)的多樣性格局和動態(tài)，為害蟲管理提供新思路。

［1］Voller A，Bartlett A，et al.The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）［J］.J Gen Virol，1976，33（1）：165-167.

［2］Clark M F，Adams A N，Thresh J M，et al.The detection of Plum Pox and other viruses in woody plants by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Acta Horticulturae 67：X International Symposium on Fruit Tree Virus Diseases，1976，67：3.

［3］Bossennec J M，Boudazin G，Maury Y，et al.大豆（阿同納、Glycine max L.M.“Altona”）胚軸內(nèi)大豆花葉病毒（SMV）分布的ELISA研究［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1986，17（1）：37-40.

［4］張成良，張作芳.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)—Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附法在檢測植物病毒上的應(yīng)用［J］.植物檢疫參考資料，1982，15-33.

［5］Koenig R.ELISA in the study of homologous and heterologous reactions of plant virus［J］.J Gen Virol，1978，40：309-318.

［6］Barbara A D，Clark M F，Thresh M，et al.Rapid detection and serotyping of prunus necrotic ringspot virus in perennial crops by enzyme-linked immunosorbent assay［J］.Ann Appl Biol，1978，90（3）：395-399.

［7］李彥勇.應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)對蕪菁花葉病毒血清學(xué)關(guān)系的研究［J］.植物病理學(xué)報，1984，14（4）：219-224.

［8］李瑛，黃惠英，張金文，等.蘭州百合病毒多重PCR和ELISA檢測體系的比較與應(yīng)用［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46（3）：59-64.

［9］施曼玲，吳建群，郭維，等.蕪菁花葉病毒單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用［J］.微生物學(xué)報，2004，44（2）：185-188.

［10］趙榮樂，鄭光宇.在新疆發(fā)生的蕪菁花葉病毒的鑒定［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，38（6）：805-809.

［11］Fargette D，Jenniskens M J，Peters D.Acquisition and transmission of pea enation mosaic virus by the individual pea aphid［J］.Phytopathology，1982，72（11）：1386-1390.

［12］寧紅，陶家鳳，江式富.用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌的研究［J］.植物檢疫，1991，2：94-97.

［13］楊蘇聲，謝小保，李季倫.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）對大豆根瘤菌的鑒定［J］.微生物學(xué)通報，1993，20（3）：129-133.

［14］姜榮文，張學(xué)江.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）鑒定根瘤菌血清型和測定大田接種回收率［J］.微生物學(xué)通報，1989，16（6）：322-324.

［15］馬貴龍，高潔.用ELISA法檢測煙草種子帶有赤星病菌（Alternaria alternata）的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，17（3）：21-25.

［16］竇坦德，李寶篤，沈崇堯.快速檢測大豆疫霉菌的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)研究［J］.植物檢疫，1997，3：138-142.

［17］楊壽旺，李睿，周振達(dá)，等.ELISA質(zhì)控存在的問題探討［J］.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2011，34（5）：334-336.

Application and Quality Control of ELISA in Plant Quarantine

Liang Xinmiao，Bian Yong，Wang Wanchun，Li Jianguang，Zhang Wei，Wei Haiyan，Liu Laifu*
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing，100026）

The application and progress of ELISA in plant virus，fungi and bacterium are presented，and the quality control of ELISA in plant quarantine is discussed.

ELISA；Plant Quarantine；Quality Control

R446.61

E-mail：liangxm@bjciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：liulf@bjciq.gov.cn

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2013IK306）

2015-06-09