內(nèi)皮型一氧化氮合酶與缺血性腦血管?、?/h1>
2015-01-24 05:27:07朱艷含羅勇
中國康復(fù)理論與實(shí)踐 2015年5期
朱艷含，羅勇
內(nèi)皮型一氧化氮合酶與缺血性腦血管?、?/p>
朱艷含，羅勇
內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及其產(chǎn)物一氧化氮(NO)可以調(diào)節(jié)缺血性腦血管疾病發(fā)作后血流量的恢復(fù)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及促進(jìn)神經(jīng)血管的再生；eNOS基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。本文就eNOS與缺血性腦血管病之間的相互關(guān)系做一綜述。
缺血性腦血管?。粌?nèi)皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；基因多態(tài)性；內(nèi)皮祖細(xì)胞；綜述
[本文著錄格式]朱艷含，羅勇.內(nèi)皮型一氧化氮合酶與缺血性腦血管病[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(5):501-504.
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腦血管疾病是目前導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，存活者中大部分遺留有嚴(yán)重殘疾，且死亡率極高。缺血性腦血管病是腦血管疾病的最常見類型，約占70%，防治缺血性腦血管病在整個(gè)腦血管疾病的防治中具有重要意義。目前，越來越多的研究從分子層面來闡釋與腦缺血預(yù)后相關(guān)的機(jī)制。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及其產(chǎn)物一氧化氮(nitric oxide,NO)是缺血性腦血管病分子研究的關(guān)鍵物質(zhì)。既往研究表明，eNOS可以通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)血流量，降低急性腦缺血后的損傷并促其恢復(fù)；同時(shí)，發(fā)揮抗炎以及促神經(jīng)血管再生[1-3]的作用。本文就eNOS/NO在缺血性腦血管病發(fā)病后的保護(hù)作用機(jī)制，以及基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的發(fā)生關(guān)系等做一綜述。
1 eNOS及其產(chǎn)物NO的生物學(xué)特征
Furchgott等1980年發(fā)現(xiàn)了一種可以使血管平滑肌松弛的小分子物質(zhì)，命名為血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子(endothelium-derived relaxing factor,EDRF)[4]，后被證實(shí)為NO。生理作用下，NO具有維持血管張力恒定的作用。在血流沖擊和循環(huán)張力等刺激下，管腔內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞可釋放NO，維持血管內(nèi)血流量的相對穩(wěn)定。其機(jī)制可能是NO激活鳥苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平升高，繼而激活cAMP依賴的蛋白激酶G，松弛平滑肌，從而導(dǎo)致血管舒張。
機(jī)體內(nèi)NO的產(chǎn)生是由NOS催化L-精氨酸生成。由于NO的半衰期極短，故大多數(shù)研究集中在催化生成NO的NOS上。NOS的亞型主要有3種，根據(jù)來源不同分為神經(jīng)元型NOS (nNOS)、誘生型NOS(iNOS)和eNOS。nNOS主要存在于神經(jīng)細(xì)胞，與神經(jīng)信息的傳遞有關(guān)；iNOS主要存在于肺泡巨噬細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞，與某些自身免疫性疾病及感染性休克等的發(fā)生有關(guān)；eNOS則是主要存在于內(nèi)皮組織的Ca2+依賴型NOS，在腦缺血過程中起到積極的保護(hù)作用。eNOS由兩個(gè)相同亞基組成的二聚體結(jié)構(gòu)構(gòu)成。每個(gè)亞基又分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)，c-端為還原區(qū)，包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced,NADPH)、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)及鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)等結(jié)合位
點(diǎn)；N-端為氧化區(qū)，包含血紅素、四氫生物蝶呤(BH4)、L-精氨酸等結(jié)合位點(diǎn)[5]。兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)各自獨(dú)立折疊行使功能。
2 eNOS的調(diào)節(jié)機(jī)制
2.1 激活
eNOS的激活是通過多條轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用、相互協(xié)調(diào)來完成的。當(dāng)血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變時(shí)，血管內(nèi)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力可有效活化血管內(nèi)皮細(xì)胞上的eNOS，NO釋放增加，血管平滑肌舒張，維持血流量的相對穩(wěn)定，但具體作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜[6-8]。
2.1.1 Ca2+/CaM激活通路
大部分eNOS存在于內(nèi)皮細(xì)胞小窩(caveolae)上，與小窩蛋白(caveolin-1)結(jié)合，處于失活狀態(tài)。在緩激肽、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺血再灌注損傷等各種因素的刺激下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，促使CaM將caveolin-1從eNOS-caveolin-1復(fù)合物中置換出來。此時(shí)，eNOS-CaM與eNOS-caveolin-1構(gòu)成比發(fā)生改變，置換出來的eNOS發(fā)生磷酸化并被激活，從而釋放出更多的NO。
2.1.2 PI3K/Akt激活通路
eNOS是PI3K/Akt通路的下游信號分子。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)與Gi蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)皮分化基因家族受體-1(endothelial differentialtion gene receptor 1, EDGR-1)結(jié)合后，可激活絲/蘇氨酸蛋白激酶B(Akt)并促其底物eNOS磷酸化，激活eNOS。當(dāng)PI3K/Akt通路被阻斷后，S1P誘導(dǎo)的eNOS磷酸化作用減弱，NO釋放減少。此外，熱休克蛋白90(HSP90)作為與caveolin-1作用相反的蛋白，可通過刺激eNOS-caveolin-1復(fù)合物的解離，促進(jìn)CaM對eNOS的激活。研究表明，雌激素、胰島素等也可通過PI3K/Akt通路在Ser1179/ 1177磷酸化eNOS，促進(jìn)NO的釋放。
2.2 解偶聯(lián)
eNOS解偶聯(lián)是指在某些病理情況下(如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及長期吸煙等)，eNOS不再誘導(dǎo)NO生成，而促進(jìn)超氧化物合成。此時(shí)，機(jī)體內(nèi)增多的超氧化物引起應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致并加重內(nèi)皮功能障礙。目前研究發(fā)現(xiàn)，引起eNOS脫偶聯(lián)的機(jī)制如下[9-13]。
2.2.1 BH4缺乏
BH4是eNOS的重要輔助因子。BH4缺乏時(shí)，eNOS的活性降低，不能充分催化L-精氨酸生成NO，此時(shí)，超氧化物生成增多。超氧化物一方面可與NO反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的ONOO-；另一方面，可以氧化BH4生成二氫生物蝶呤(BH2)，導(dǎo)致兩者之間比例失調(diào)，BH4進(jìn)一步減少，BH2增多并拮抗BH4的功能，出現(xiàn)惡性循環(huán)。
2.2.2 L-精氨酸缺乏
L-精氨酸是NO的重要來源。eNOS可以L-精氨酸為底物，利用O2生成NO和L-瓜氨酸。當(dāng)L-精氨酸缺乏時(shí)，生成NO的底物供應(yīng)不足，使催化反應(yīng)過程中本應(yīng)轉(zhuǎn)移到L-精氨酸上的電子轉(zhuǎn)移到O2上，從而生成超氧化物，導(dǎo)致進(jìn)一步eNOS的解偶聯(lián)。
由此可見，活性氧(ROS)的釋放是導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，活性氧與NO反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的ONOO-，繼而氧化BH4、L-精氨酸及eNOS活性中心的鋅指結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致BH4、L-精氨酸降低，并加重eNOS的解偶聯(lián)。
3 eNOS與缺血性腦血管病
3.1 eNOS基因多態(tài)性與缺血性腦血管病
研究表明，eNOS基因多態(tài)性是缺血性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。eNOS的基因存在于染色體7q35-36，有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，共21 kb，編碼含有1203個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
人類基因多態(tài)性可分為3大類：DNA片段長度多態(tài)性、DNA重復(fù)序列多態(tài)性及單核苷酸多態(tài)性。目前研究發(fā)現(xiàn)，與缺血性腦血管病密切相關(guān)聯(lián)的eNOS基因多態(tài)性如下。
3.1.1 第4內(nèi)含子27 bp可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性
根據(jù)重復(fù)次數(shù)的不同分為重復(fù)4次的a等位基因和重復(fù)5次的b等位基因，基因型包括aa、ab、bb。周翔魚等對寧夏地區(qū)596名健康對照者、468例缺血性腦血管病患者的eNOS基因第4內(nèi)含子可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeat,VNTR)進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)腦梗死組eNOS4a攜帶者明顯多于對照組[14]。Hou等研究中國人群中364例缺血性腦卒中患者與516名健康對照者eNOS基因第4內(nèi)含子27 bp重復(fù)多態(tài)性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)eNOS基因第4內(nèi)含子a等位基因可能是中國人缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。中國人群中，a等位基因相較于b等位基因更具病理意義。
3.1.2 G894T多態(tài)性
G894T即第7外顯子上第894位堿基G突變成T，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白產(chǎn)物發(fā)生改變，由谷氨酸變?yōu)樘於彼?Glu298Asp)。章志亮等通過檢測浙江漢族128名正常人及132例腦梗死患者的eNOS基因G894T點(diǎn)突變頻率，發(fā)現(xiàn)eNOS基因G894T突變可能是浙江漢族人群腦梗死遺傳易感性的基因標(biāo)志之一[16]。牛朋朋等搜集國內(nèi)外公開發(fā)表的有關(guān)中國人eNOS基因G894T多態(tài)性與腦梗死關(guān)系的研究文獻(xiàn)，進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明，中國人eNOS基因G894T多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病具有相關(guān)性，攜帶基因型TT、GT及等位基因T可增加患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)[17]。Glu298Asp基因突變導(dǎo)致的腦梗死發(fā)生的基因易感性，可能與NO合成減少有關(guān)。
3.1.3 T786C多態(tài)性
T786C即5'端引物區(qū)第786位上堿基T突變?yōu)镃。Cheng等對中國人群中309例缺血性腦卒中患者與309名健康對照者eNOS基因T786C多態(tài)性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明T786C多態(tài)性可增加中國人群缺血性腦卒中發(fā)生的易感性[18]。Niu等通過Meta分析，發(fā)現(xiàn)T786C多態(tài)性與亞洲人群患缺血性腦卒中密切相關(guān)[19]。
T786C多態(tài)性增加缺血性腦卒中發(fā)生的易感性可能與T786C突變降低啟動(dòng)子的活性，從而降低eNOS基因轉(zhuǎn)錄起始過程的效率，使eNOS合成減少，繼而使NO的含量降低有關(guān)。
eNOS基因多態(tài)性對不同種族罹患缺血性腦卒中的易感性存在差異，但上述3種eNOS基因多態(tài)性作為中國人群缺血性
腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已基本明確。且有研究表明，eNOS基因多態(tài)性可能是中國青年發(fā)生缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因子[20]。
3.2 eNOS與內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管生成
腦缺血后神經(jīng)再生和血管生成可有效促進(jìn)其功能的恢復(fù)，其中血管生成可促進(jìn)腦循環(huán)的重建，為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建打下營養(yǎng)基礎(chǔ)。研究表明，腦缺血后機(jī)體外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPCs)數(shù)量增高，且增高的水平與缺血性腦血管病的預(yù)后明顯相關(guān)。Iskander等通過靜脈移植提高外周血中EPCs的數(shù)量，磁共振成像技術(shù)追蹤磁標(biāo)記的EPCs，發(fā)現(xiàn)移植的EPCs可歸巢到缺血病灶，參與血管生成及神經(jīng)發(fā)生[21]。
外源性移植雖可提高外周血EPCs，但存在諸多缺陷，如移植存活率低、免疫排斥反應(yīng)、治療時(shí)間窗難以把控、創(chuàng)傷大等。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)部，尤其是骨髓本身即為EPCs的巨大儲(chǔ)存庫，故若能探索到積極有效的方法動(dòng)員內(nèi)源性EPCs進(jìn)入外周血，進(jìn)而歸巢至缺血腦病灶，參與血管生成，將具有十分深遠(yuǎn)的意義。我們曾發(fā)現(xiàn)eNOS促腦缺血后生成與對EPCs的動(dòng)員作用及其生物學(xué)功能的影響等密切相關(guān)。
3.2.1 eNOS與EPCs的動(dòng)員
EPCs的動(dòng)員是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過程。通過重建EPCs的細(xì)胞外基質(zhì)，使EPCs脫離骨髓微環(huán)境是動(dòng)員EPCs的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該過程由基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)介導(dǎo)。MMP-9的激活和釋放為EPCs動(dòng)員過程中細(xì)胞外基質(zhì)重建所必需[22]。然而MMP-9的激活是NO依賴性的。在eNOS基因敲除小鼠，MMP-9活性急劇下降[23]。由此可見，eNOS的激活是EPCs動(dòng)員不可缺少的因子，eNOS促進(jìn)腦缺血后血管生成可能是通過促進(jìn)EPCs的動(dòng)員來完成的。
Aicher等認(rèn)為，eNOS是血管新生必不可少的因子；敲除小鼠eNOS基因后，VEGF誘導(dǎo)的骨髓內(nèi)EPCs動(dòng)員的能力被削弱，生成新生血管的能力也降低；通過EPCs的移植，可以改善eNOS缺乏小鼠的血管生成缺陷問題[24]。Zhou等發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可有效提高外周血中EPCs的數(shù)量，并促進(jìn)缺血區(qū)血管再生；但當(dāng)eNOS缺乏時(shí)上述作用被抑制[25]。
3.2.2 eNOS與EPCs的生物學(xué)功能
組織缺血后，內(nèi)源性EPCs在缺血缺氧等條件的驅(qū)動(dòng)下可歸巢至缺血病灶，并參與損傷內(nèi)皮的修復(fù)。EPCs的增殖、遷移等能力在血管損傷后的再生及修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
研究發(fā)現(xiàn)，eNOS可以通過介導(dǎo)EPCs的增殖、遷移及黏附能力，促進(jìn)血管再生。Yang等發(fā)現(xiàn)，喬松素可以提高EPCs的增殖、遷移及黏附能力，促進(jìn)體外EPCs形成管腔樣結(jié)構(gòu)；喬松素對EPCs的這種刺激作用，尤其是促增殖、黏附作用可被eNOS的抑制劑L-NAME阻斷[26]。Yu等發(fā)現(xiàn)，使用肝X受體(LXR)激動(dòng)劑可有效刺激EPCs的增殖、遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)受損內(nèi)皮的再生；然而，經(jīng)L-NAME預(yù)處理后的EPCs，LXR對其增殖、遷移能力的促進(jìn)作用明顯受到抑制[27]。研究證明，胸腺素β4(Tβ4)對缺血性腦血管病具有保護(hù)作用[28]，可通過調(diào)節(jié)EPCs的多種生物學(xué)功能，如增殖、遷移及防止EPCs的衰老等，促進(jìn)缺血腦區(qū)的血管再生。Li等發(fā)現(xiàn)，eNOS被抑制后，Tβ4減緩EPCs衰老的作用顯著降低[29]。
由此可見，eNOS是調(diào)控EPCs生物學(xué)功能的一個(gè)重要信號分子，除了刺激EPCs的增殖、遷移及黏附能力來促內(nèi)皮再生，還可通過防止EPCs的衰老及凋亡來提高其生存率。
3.3 NO供體治療缺血性腦血管病
機(jī)體內(nèi)的NO是由NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生的一種能夠促進(jìn)體內(nèi)血液循環(huán)流通的信號分子。有研究表明，使用NO供體可以改善局灶腦缺血大鼠早期的皮質(zhì)灌注，并減少腦梗死體積[30]。應(yīng)用NO供體治療缺血性腦血管病是一種極具吸引力的選擇。
eNOS及其產(chǎn)物NO，不僅可以改善缺血性腦血管病的血流灌注，還可促進(jìn)動(dòng)脈形成。動(dòng)脈生成是缺血性腦組織灌注恢復(fù)的保障，對缺血性腦血管病后期的功能恢復(fù)也起著重要的作用。Cui等分別將18只野生型成年大鼠及36只eNOS基因敲除大鼠制作成短暫性局灶腦缺血模型，其中一部分eNOS基因敲除的模型大鼠予以NO供體(DETA/NONOdate)治療，2周內(nèi)分別對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分及死亡率測評，發(fā)現(xiàn)eNOS基因敲除的大鼠神經(jīng)功能評分及死亡率高于野生組，DETA/ NONOdate治療后，死亡率顯著減少，且神經(jīng)功能明顯得到改善；eNOS基因敲除的大鼠經(jīng)DETA/NONOdate治療后，通過提高血管平滑肌細(xì)胞的增殖及缺血病灶區(qū)動(dòng)脈血管的密度、直徑，促進(jìn)動(dòng)脈生成，進(jìn)而改善腦缺血病灶區(qū)的血流灌注[31]。使用NO供體治療的局灶腦缺血大鼠，毛細(xì)血管生成能力明顯高于對照組，可能是通過上調(diào)血管生成素1及其受體(Ang1/Tie2)通路來實(shí)現(xiàn)[32]。另外，NO供體也可通過介導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子及其受體(SDF-1/CXCR4)軸促骨髓基質(zhì)細(xì)胞向缺血腦區(qū)移行，從而提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞的治療潛能[33]。
NO供體還具有神經(jīng)保護(hù)作用。Khan等使用多種結(jié)構(gòu)不同的NO供體治療缺血性腦血管病大鼠，并比較它們的神經(jīng)保護(hù)功效，發(fā)現(xiàn)它們的神經(jīng)保護(hù)作用取決于各自降低缺血性腦血管病大鼠大腦及外周血中氧化應(yīng)激的能力[34]。
4 結(jié)語
eNOS及其產(chǎn)物NO在機(jī)體內(nèi)扮演著傳遞信息、調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)功能的角色。在缺血性腦血管病中，由eNOS催化合成的NO具有改善腦循環(huán)、提高血流灌注的作用，但過多的NO可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，不利于缺血性腦病的神經(jīng)功能恢復(fù)。如何有效利用其正性作用，抑制其負(fù)性作用是今后研究的重點(diǎn)之一。
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Endothelial Nitric Oxide Synthase and Ischemic Cerebrovascular Disease(review)
ZHU Yan-han,LUO Yong
Department of Neurology,the FirstAffiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China
Endothelial nitric oxide synthase(eNOS)and nitric oxide(NO)can adjust the recovery of blood flow after cerebral ischemia,inhibit inflammatory reaction and promote the regeneration of the nerve and blood vessels.The gene polymorphism of eNOS is closely related to the onset of ischemic cerebrovascular disease.This article reviewed the relationship between eNOS and ischemic cerebrovascular disease.
ischemic cerebrovascular disease;endothelial nitric oxide synthase;nitric oxide;gene polymorphism;endothelial progenitor cell;review
10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.002
R743.3
A
1006-9771(2015)05-0501-04
2015-01-29
2015-03-25)
1.教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題(No.20095503110001)；2.重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重點(diǎn)項(xiàng)目(No. ZY20131027)；3.重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No.渝中醫(yī)2005-B-24)。
重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市400016。作者簡介：朱艷含(1989-)，女，漢族，湖北襄陽市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：羅勇(1965-)，男，漢族，四川達(dá)州市人，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail:Luoyong1998@163.com。
朱艷含，羅勇
內(nèi)皮型一氧化氮合酶與缺血性腦血管?、?/p>
朱艷含，羅勇
內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及其產(chǎn)物一氧化氮(NO)可以調(diào)節(jié)缺血性腦血管疾病發(fā)作后血流量的恢復(fù)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生以及促進(jìn)神經(jīng)血管的再生；eNOS基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。本文就eNOS與缺血性腦血管病之間的相互關(guān)系做一綜述。
缺血性腦血管?。粌?nèi)皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；基因多態(tài)性；內(nèi)皮祖細(xì)胞；綜述
[本文著錄格式]朱艷含，羅勇.內(nèi)皮型一氧化氮合酶與缺血性腦血管病[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(5):501-504.
CITED AS:Zhu YH,Luo Y.Endothelial nitric oxide synthase and ischemic cerebrovascular disease(review)[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(5):501-504.
腦血管疾病是目前導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，存活者中大部分遺留有嚴(yán)重殘疾，且死亡率極高。缺血性腦血管病是腦血管疾病的最常見類型，約占70%，防治缺血性腦血管病在整個(gè)腦血管疾病的防治中具有重要意義。目前，越來越多的研究從分子層面來闡釋與腦缺血預(yù)后相關(guān)的機(jī)制。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及其產(chǎn)物一氧化氮(nitric oxide,NO)是缺血性腦血管病分子研究的關(guān)鍵物質(zhì)。既往研究表明，eNOS可以通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)血流量，降低急性腦缺血后的損傷并促其恢復(fù)；同時(shí)，發(fā)揮抗炎以及促神經(jīng)血管再生[1-3]的作用。本文就eNOS/NO在缺血性腦血管病發(fā)病后的保護(hù)作用機(jī)制，以及基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的發(fā)生關(guān)系等做一綜述。
1 eNOS及其產(chǎn)物NO的生物學(xué)特征
Furchgott等1980年發(fā)現(xiàn)了一種可以使血管平滑肌松弛的小分子物質(zhì)，命名為血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子(endothelium-derived relaxing factor,EDRF)[4]，后被證實(shí)為NO。生理作用下，NO具有維持血管張力恒定的作用。在血流沖擊和循環(huán)張力等刺激下，管腔內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞可釋放NO，維持血管內(nèi)血流量的相對穩(wěn)定。其機(jī)制可能是NO激活鳥苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平升高，繼而激活cAMP依賴的蛋白激酶G，松弛平滑肌，從而導(dǎo)致血管舒張。
機(jī)體內(nèi)NO的產(chǎn)生是由NOS催化L-精氨酸生成。由于NO的半衰期極短，故大多數(shù)研究集中在催化生成NO的NOS上。NOS的亞型主要有3種，根據(jù)來源不同分為神經(jīng)元型NOS (nNOS)、誘生型NOS(iNOS)和eNOS。nNOS主要存在于神經(jīng)細(xì)胞，與神經(jīng)信息的傳遞有關(guān)；iNOS主要存在于肺泡巨噬細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞，與某些自身免疫性疾病及感染性休克等的發(fā)生有關(guān)；eNOS則是主要存在于內(nèi)皮組織的Ca2+依賴型NOS，在腦缺血過程中起到積極的保護(hù)作用。eNOS由兩個(gè)相同亞基組成的二聚體結(jié)構(gòu)構(gòu)成。每個(gè)亞基又分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)，c-端為還原區(qū)，包含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced,NADPH)、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)及鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)等結(jié)合位
點(diǎn)；N-端為氧化區(qū)，包含血紅素、四氫生物蝶呤(BH4)、L-精氨酸等結(jié)合位點(diǎn)[5]。兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)各自獨(dú)立折疊行使功能。
2 eNOS的調(diào)節(jié)機(jī)制
2.1 激活
eNOS的激活是通過多條轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用、相互協(xié)調(diào)來完成的。當(dāng)血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變時(shí)，血管內(nèi)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力可有效活化血管內(nèi)皮細(xì)胞上的eNOS，NO釋放增加，血管平滑肌舒張，維持血流量的相對穩(wěn)定，但具體作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜[6-8]。
2.1.1 Ca2+/CaM激活通路
大部分eNOS存在于內(nèi)皮細(xì)胞小窩(caveolae)上，與小窩蛋白(caveolin-1)結(jié)合，處于失活狀態(tài)。在緩激肽、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺血再灌注損傷等各種因素的刺激下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，促使CaM將caveolin-1從eNOS-caveolin-1復(fù)合物中置換出來。此時(shí)，eNOS-CaM與eNOS-caveolin-1構(gòu)成比發(fā)生改變，置換出來的eNOS發(fā)生磷酸化并被激活，從而釋放出更多的NO。
2.1.2 PI3K/Akt激活通路
eNOS是PI3K/Akt通路的下游信號分子。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)與Gi蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)皮分化基因家族受體-1(endothelial differentialtion gene receptor 1, EDGR-1)結(jié)合后，可激活絲/蘇氨酸蛋白激酶B(Akt)并促其底物eNOS磷酸化，激活eNOS。當(dāng)PI3K/Akt通路被阻斷后，S1P誘導(dǎo)的eNOS磷酸化作用減弱，NO釋放減少。此外，熱休克蛋白90(HSP90)作為與caveolin-1作用相反的蛋白，可通過刺激eNOS-caveolin-1復(fù)合物的解離，促進(jìn)CaM對eNOS的激活。研究表明，雌激素、胰島素等也可通過PI3K/Akt通路在Ser1179/ 1177磷酸化eNOS，促進(jìn)NO的釋放。
2.2 解偶聯(lián)
eNOS解偶聯(lián)是指在某些病理情況下(如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及長期吸煙等)，eNOS不再誘導(dǎo)NO生成，而促進(jìn)超氧化物合成。此時(shí)，機(jī)體內(nèi)增多的超氧化物引起應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致并加重內(nèi)皮功能障礙。目前研究發(fā)現(xiàn)，引起eNOS脫偶聯(lián)的機(jī)制如下[9-13]。
2.2.1 BH4缺乏
BH4是eNOS的重要輔助因子。BH4缺乏時(shí)，eNOS的活性降低，不能充分催化L-精氨酸生成NO，此時(shí)，超氧化物生成增多。超氧化物一方面可與NO反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的ONOO-；另一方面，可以氧化BH4生成二氫生物蝶呤(BH2)，導(dǎo)致兩者之間比例失調(diào)，BH4進(jìn)一步減少，BH2增多并拮抗BH4的功能，出現(xiàn)惡性循環(huán)。
2.2.2 L-精氨酸缺乏
L-精氨酸是NO的重要來源。eNOS可以L-精氨酸為底物，利用O2生成NO和L-瓜氨酸。當(dāng)L-精氨酸缺乏時(shí)，生成NO的底物供應(yīng)不足，使催化反應(yīng)過程中本應(yīng)轉(zhuǎn)移到L-精氨酸上的電子轉(zhuǎn)移到O2上，從而生成超氧化物，導(dǎo)致進(jìn)一步eNOS的解偶聯(lián)。
由此可見，活性氧(ROS)的釋放是導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，活性氧與NO反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的ONOO-，繼而氧化BH4、L-精氨酸及eNOS活性中心的鋅指結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致BH4、L-精氨酸降低，并加重eNOS的解偶聯(lián)。
3 eNOS與缺血性腦血管病
3.1 eNOS基因多態(tài)性與缺血性腦血管病
研究表明，eNOS基因多態(tài)性是缺血性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。eNOS的基因存在于染色體7q35-36，有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，共21 kb，編碼含有1203個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
人類基因多態(tài)性可分為3大類：DNA片段長度多態(tài)性、DNA重復(fù)序列多態(tài)性及單核苷酸多態(tài)性。目前研究發(fā)現(xiàn)，與缺血性腦血管病密切相關(guān)聯(lián)的eNOS基因多態(tài)性如下。
3.1.1 第4內(nèi)含子27 bp可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性
根據(jù)重復(fù)次數(shù)的不同分為重復(fù)4次的a等位基因和重復(fù)5次的b等位基因，基因型包括aa、ab、bb。周翔魚等對寧夏地區(qū)596名健康對照者、468例缺血性腦血管病患者的eNOS基因第4內(nèi)含子可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeat,VNTR)進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)腦梗死組eNOS4a攜帶者明顯多于對照組[14]。Hou等研究中國人群中364例缺血性腦卒中患者與516名健康對照者eNOS基因第4內(nèi)含子27 bp重復(fù)多態(tài)性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)eNOS基因第4內(nèi)含子a等位基因可能是中國人缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。中國人群中，a等位基因相較于b等位基因更具病理意義。
3.1.2 G894T多態(tài)性
G894T即第7外顯子上第894位堿基G突變成T，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白產(chǎn)物發(fā)生改變，由谷氨酸變?yōu)樘於彼?Glu298Asp)。章志亮等通過檢測浙江漢族128名正常人及132例腦梗死患者的eNOS基因G894T點(diǎn)突變頻率，發(fā)現(xiàn)eNOS基因G894T突變可能是浙江漢族人群腦梗死遺傳易感性的基因標(biāo)志之一[16]。牛朋朋等搜集國內(nèi)外公開發(fā)表的有關(guān)中國人eNOS基因G894T多態(tài)性與腦梗死關(guān)系的研究文獻(xiàn)，進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明，中國人eNOS基因G894T多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病具有相關(guān)性，攜帶基因型TT、GT及等位基因T可增加患腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)[17]。Glu298Asp基因突變導(dǎo)致的腦梗死發(fā)生的基因易感性，可能與NO合成減少有關(guān)。
3.1.3 T786C多態(tài)性
T786C即5'端引物區(qū)第786位上堿基T突變?yōu)镃。Cheng等對中國人群中309例缺血性腦卒中患者與309名健康對照者eNOS基因T786C多態(tài)性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明T786C多態(tài)性可增加中國人群缺血性腦卒中發(fā)生的易感性[18]。Niu等通過Meta分析，發(fā)現(xiàn)T786C多態(tài)性與亞洲人群患缺血性腦卒中密切相關(guān)[19]。
T786C多態(tài)性增加缺血性腦卒中發(fā)生的易感性可能與T786C突變降低啟動(dòng)子的活性，從而降低eNOS基因轉(zhuǎn)錄起始過程的效率，使eNOS合成減少，繼而使NO的含量降低有關(guān)。
eNOS基因多態(tài)性對不同種族罹患缺血性腦卒中的易感性存在差異，但上述3種eNOS基因多態(tài)性作為中國人群缺血性
腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已基本明確。且有研究表明，eNOS基因多態(tài)性可能是中國青年發(fā)生缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因子[20]。
3.2 eNOS與內(nèi)皮祖細(xì)胞促血管生成
腦缺血后神經(jīng)再生和血管生成可有效促進(jìn)其功能的恢復(fù)，其中血管生成可促進(jìn)腦循環(huán)的重建，為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建打下營養(yǎng)基礎(chǔ)。研究表明，腦缺血后機(jī)體外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPCs)數(shù)量增高，且增高的水平與缺血性腦血管病的預(yù)后明顯相關(guān)。Iskander等通過靜脈移植提高外周血中EPCs的數(shù)量，磁共振成像技術(shù)追蹤磁標(biāo)記的EPCs，發(fā)現(xiàn)移植的EPCs可歸巢到缺血病灶，參與血管生成及神經(jīng)發(fā)生[21]。
外源性移植雖可提高外周血EPCs，但存在諸多缺陷，如移植存活率低、免疫排斥反應(yīng)、治療時(shí)間窗難以把控、創(chuàng)傷大等。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)部，尤其是骨髓本身即為EPCs的巨大儲(chǔ)存庫，故若能探索到積極有效的方法動(dòng)員內(nèi)源性EPCs進(jìn)入外周血，進(jìn)而歸巢至缺血腦病灶，參與血管生成，將具有十分深遠(yuǎn)的意義。我們曾發(fā)現(xiàn)eNOS促腦缺血后生成與對EPCs的動(dòng)員作用及其生物學(xué)功能的影響等密切相關(guān)。
3.2.1 eNOS與EPCs的動(dòng)員
EPCs的動(dòng)員是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過程。通過重建EPCs的細(xì)胞外基質(zhì)，使EPCs脫離骨髓微環(huán)境是動(dòng)員EPCs的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。該過程由基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)介導(dǎo)。MMP-9的激活和釋放為EPCs動(dòng)員過程中細(xì)胞外基質(zhì)重建所必需[22]。然而MMP-9的激活是NO依賴性的。在eNOS基因敲除小鼠，MMP-9活性急劇下降[23]。由此可見，eNOS的激活是EPCs動(dòng)員不可缺少的因子，eNOS促進(jìn)腦缺血后血管生成可能是通過促進(jìn)EPCs的動(dòng)員來完成的。
Aicher等認(rèn)為，eNOS是血管新生必不可少的因子；敲除小鼠eNOS基因后，VEGF誘導(dǎo)的骨髓內(nèi)EPCs動(dòng)員的能力被削弱，生成新生血管的能力也降低；通過EPCs的移植，可以改善eNOS缺乏小鼠的血管生成缺陷問題[24]。Zhou等發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可有效提高外周血中EPCs的數(shù)量，并促進(jìn)缺血區(qū)血管再生；但當(dāng)eNOS缺乏時(shí)上述作用被抑制[25]。
3.2.2 eNOS與EPCs的生物學(xué)功能
組織缺血后，內(nèi)源性EPCs在缺血缺氧等條件的驅(qū)動(dòng)下可歸巢至缺血病灶，并參與損傷內(nèi)皮的修復(fù)。EPCs的增殖、遷移等能力在血管損傷后的再生及修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
研究發(fā)現(xiàn)，eNOS可以通過介導(dǎo)EPCs的增殖、遷移及黏附能力，促進(jìn)血管再生。Yang等發(fā)現(xiàn)，喬松素可以提高EPCs的增殖、遷移及黏附能力，促進(jìn)體外EPCs形成管腔樣結(jié)構(gòu)；喬松素對EPCs的這種刺激作用，尤其是促增殖、黏附作用可被eNOS的抑制劑L-NAME阻斷[26]。Yu等發(fā)現(xiàn)，使用肝X受體(LXR)激動(dòng)劑可有效刺激EPCs的增殖、遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)受損內(nèi)皮的再生；然而，經(jīng)L-NAME預(yù)處理后的EPCs，LXR對其增殖、遷移能力的促進(jìn)作用明顯受到抑制[27]。研究證明，胸腺素β4(Tβ4)對缺血性腦血管病具有保護(hù)作用[28]，可通過調(diào)節(jié)EPCs的多種生物學(xué)功能，如增殖、遷移及防止EPCs的衰老等，促進(jìn)缺血腦區(qū)的血管再生。Li等發(fā)現(xiàn)，eNOS被抑制后，Tβ4減緩EPCs衰老的作用顯著降低[29]。
由此可見，eNOS是調(diào)控EPCs生物學(xué)功能的一個(gè)重要信號分子，除了刺激EPCs的增殖、遷移及黏附能力來促內(nèi)皮再生，還可通過防止EPCs的衰老及凋亡來提高其生存率。
3.3 NO供體治療缺血性腦血管病
機(jī)體內(nèi)的NO是由NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生的一種能夠促進(jìn)體內(nèi)血液循環(huán)流通的信號分子。有研究表明，使用NO供體可以改善局灶腦缺血大鼠早期的皮質(zhì)灌注，并減少腦梗死體積[30]。應(yīng)用NO供體治療缺血性腦血管病是一種極具吸引力的選擇。
eNOS及其產(chǎn)物NO，不僅可以改善缺血性腦血管病的血流灌注，還可促進(jìn)動(dòng)脈形成。動(dòng)脈生成是缺血性腦組織灌注恢復(fù)的保障，對缺血性腦血管病后期的功能恢復(fù)也起著重要的作用。Cui等分別將18只野生型成年大鼠及36只eNOS基因敲除大鼠制作成短暫性局灶腦缺血模型，其中一部分eNOS基因敲除的模型大鼠予以NO供體(DETA/NONOdate)治療，2周內(nèi)分別對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分及死亡率測評，發(fā)現(xiàn)eNOS基因敲除的大鼠神經(jīng)功能評分及死亡率高于野生組，DETA/ NONOdate治療后，死亡率顯著減少，且神經(jīng)功能明顯得到改善；eNOS基因敲除的大鼠經(jīng)DETA/NONOdate治療后，通過提高血管平滑肌細(xì)胞的增殖及缺血病灶區(qū)動(dòng)脈血管的密度、直徑，促進(jìn)動(dòng)脈生成，進(jìn)而改善腦缺血病灶區(qū)的血流灌注[31]。使用NO供體治療的局灶腦缺血大鼠，毛細(xì)血管生成能力明顯高于對照組，可能是通過上調(diào)血管生成素1及其受體(Ang1/Tie2)通路來實(shí)現(xiàn)[32]。另外，NO供體也可通過介導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子及其受體(SDF-1/CXCR4)軸促骨髓基質(zhì)細(xì)胞向缺血腦區(qū)移行，從而提高骨髓基質(zhì)細(xì)胞的治療潛能[33]。
NO供體還具有神經(jīng)保護(hù)作用。Khan等使用多種結(jié)構(gòu)不同的NO供體治療缺血性腦血管病大鼠，并比較它們的神經(jīng)保護(hù)功效，發(fā)現(xiàn)它們的神經(jīng)保護(hù)作用取決于各自降低缺血性腦血管病大鼠大腦及外周血中氧化應(yīng)激的能力[34]。
4 結(jié)語
eNOS及其產(chǎn)物NO在機(jī)體內(nèi)扮演著傳遞信息、調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)功能的角色。在缺血性腦血管病中，由eNOS催化合成的NO具有改善腦循環(huán)、提高血流灌注的作用，但過多的NO可產(chǎn)生神經(jīng)毒性，不利于缺血性腦病的神經(jīng)功能恢復(fù)。如何有效利用其正性作用，抑制其負(fù)性作用是今后研究的重點(diǎn)之一。
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Endothelial Nitric Oxide Synthase and Ischemic Cerebrovascular Disease(review)
ZHU Yan-han,LUO Yong
Department of Neurology,the FirstAffiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China
Endothelial nitric oxide synthase(eNOS)and nitric oxide(NO)can adjust the recovery of blood flow after cerebral ischemia,inhibit inflammatory reaction and promote the regeneration of the nerve and blood vessels.The gene polymorphism of eNOS is closely related to the onset of ischemic cerebrovascular disease.This article reviewed the relationship between eNOS and ischemic cerebrovascular disease.
ischemic cerebrovascular disease;endothelial nitric oxide synthase;nitric oxide;gene polymorphism;endothelial progenitor cell;review
10.3969/j.issn.1006-9771.2015.05.002
R743.3
A
1006-9771(2015)05-0501-04
2015-01-29
2015-03-25)
1.教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題(No.20095503110001)；2.重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研重點(diǎn)項(xiàng)目(No. ZY20131027)；3.重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No.渝中醫(yī)2005-B-24)。
重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市400016。作者簡介：朱艷含(1989-)，女，漢族，湖北襄陽市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病。通訊作者：羅勇(1965-)，男，漢族，四川達(dá)州市人，博士，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail:Luoyong1998@163.com。
