• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)及其在動物疫病檢測中的應(yīng)用

    2015-01-24 02:02:41成大榮余樹培蘇玲玲蔡樹東顧玲玲王永娟
    中國動物檢疫 2015年4期
    關(guān)鍵詞:等溫支原體特異性

    胡 成,成大榮,余樹培,趙 方,蘇玲玲,蔡樹東,顧玲玲,王永娟

    (1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

    環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)及其在動物疫病檢測中的應(yīng)用

    胡 成1,成大榮1,余樹培1,趙 方1,蘇玲玲1,蔡樹東1,顧玲玲1,王永娟2

    (1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300)

    環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)是一門新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù),因其具有高特異性、高靈敏度、簡便快捷、成本低廉等特點(diǎn),受到越來越多獸醫(yī)工作者的關(guān)注。目前,該方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病原微生物的檢測。本文就環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的原理、方法、應(yīng)用等方面進(jìn)行簡述,最后指出LAMP當(dāng)前存在的一些不足之處,并對其發(fā)展前景進(jìn)行了展望,以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù);動物疫病;應(yīng)用;檢測

    核酸的體外擴(kuò)增技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域中最常用的研究方法及重要工具之一,自20世紀(jì)80年代聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)問世以來,在分子生物學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域和傳染病檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。但是,由于核酸的檢測過程往往需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)的技能型人才、復(fù)雜的操作過程、冗長的實(shí)驗(yàn)周期等,不能適應(yīng)基層及現(xiàn)場的快速檢測需要,限制了相關(guān)技術(shù)的推廣應(yīng)用[2]。

    2000年,日本榮研株式會社的Tsugunori Notomi 等人開發(fā)了一種新型的核酸等溫擴(kuò)增方法—環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),利用該技術(shù)只需在恒溫條件下(60℃~65℃)孵育幾十分鐘即可快速完成核酸的指數(shù)級擴(kuò)增,無須購置昂貴的PCR儀,操作簡單、快速,產(chǎn)物易于檢測,特別適用于基層和現(xiàn)場一線的快速檢測[3]。短短幾年時間,該技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全、胚胎鑒定、動植

    物檢驗(yàn)檢疫、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品等多個領(lǐng)域的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用[4]。本文將選取近年來LAMP技術(shù)在動物疾病預(yù)防控制過程中病原微生物檢測方面的應(yīng)用進(jìn)行簡單綜述。

    1 技術(shù)原理

    1.1 擴(kuò)增基礎(chǔ)

    環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是通過4條特殊的引物對靶基因序列上6個不同區(qū)域進(jìn)行退火雜交,利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)提供反應(yīng)的動力,實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下完成對目的片段的大量擴(kuò)增,由于規(guī)避了常規(guī)PCR反應(yīng)的變性、退火、延伸等一系列復(fù)雜的過程,大大節(jié)省了反應(yīng)時間和成本,為臨床和現(xiàn)場一線的快速檢測提供可能[5]。

    1.2 引物設(shè)計

    環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增對引物特異性要求非常高,設(shè)計也更為復(fù)雜,需要2對引物,即2條外引物(B3/ F3)和2條內(nèi)引物(FIP/BIP):外部引物限定了擴(kuò)增的范圍,即目的片段的大小,同時為內(nèi)部引物提供了模板;內(nèi)部引物與目的片段部分互補(bǔ)并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的片段長度最好在300 bp以內(nèi),因?yàn)殡S著序列的延長擴(kuò)增效率隨之降低,超過500 bp的序列就很難擴(kuò)增了。有實(shí)驗(yàn)表明,在LAMP反應(yīng)中加入環(huán)引物(LF/LB)能夠明顯加快擴(kuò)增的速度,大大縮短檢測的時間,檢出率也有所提高。

    1.3 擴(kuò)增程序

    LAMP的擴(kuò)增過程包括:循環(huán)起始復(fù)合物的形成、循環(huán)擴(kuò)增、延伸和再循環(huán)4個階段。呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的循環(huán)起始復(fù)合物是整個LAMP反應(yīng)中最重要的環(huán)節(jié)。內(nèi)引物通過結(jié)合到莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀區(qū)域的互補(bǔ)序列上,在Bst DNA聚合酶的作用下合成、延伸并發(fā)生置換。如此往復(fù)循環(huán),形成一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)及多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)。在反應(yīng)體系中加入甜菜堿、MgSO4等成分,使得酶活性大大提升,30~60 min即可進(jìn)行結(jié)果判定[6]。

    1.4 結(jié)果判定

    1.4.1 肉眼觀察法。LAMP在合成DNA的同時會從dNTPs中析出大量副產(chǎn)物焦磷酸根離子,它們能與反應(yīng)液中的鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀,可以通過肉眼直接觀察有無乳白色渾濁來判斷擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行與否。有報道指出,擴(kuò)增結(jié)束后,經(jīng)短暫瞬時離心可使沉淀集中于管底,更加便于觀察。

    1.4.2 熒光染料法。當(dāng)反應(yīng)不徹底導(dǎo)致焦磷酸鎂沉淀不足時,往往會對判斷造成一定的偏差,產(chǎn)生假陰性或假陽性,可以通過添加適量的熒光染料(如溴化乙啶EB或SYBR Green I)的方法進(jìn)行輔助觀察:它們是高靈敏度的DNA染料,與雙鏈DNA的親和力非常高,一旦結(jié)合其熒光信號會增強(qiáng)800-1 000倍,用來檢測擴(kuò)增是否發(fā)生,可確保其準(zhǔn)確性。

    1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳法。LAMP最終的產(chǎn)物是若干莖環(huán)狀DNA片段組成的混合物,即有若干倍莖長度的環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。因此,LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下呈現(xiàn)的是典型的梯形條帶,而不是只有一條帶。

    1.4.4 濁度儀檢測法。日本榮研株式會社利用LAMP反應(yīng)過程中產(chǎn)生焦磷酸鎂乳白色沉淀在400 nm處有吸收峰的原理,研制出專門用于LAMP檢測的實(shí)時濁度儀。通過檢測沉淀的形成量,對反應(yīng)中DNA的合成量進(jìn)行反推,從而對LAMP可進(jìn)行實(shí)時檢測和定量[7]。

    2 技術(shù)特點(diǎn)

    2.1 高特異性

    針對靶基因序列上6個區(qū)域設(shè)計的4條順序相連的特異性引物,任何一處不相匹配均不能進(jìn)行反應(yīng),幾乎不可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的情況,因此可以根據(jù)是否擴(kuò)增判斷目的基因存在與否,即能夠進(jìn)行病原的定性檢測。

    2.2 高靈敏性

    LAMP的最低檢測限至少是傳統(tǒng)PCR方法的100倍以上,達(dá)到甚至超過real-time Taqman PCR的檢測水平,有報道指出最低可檢測10個拷貝或更低。

    2.3 高效快速

    經(jīng)過優(yōu)化過的體系,整個擴(kuò)增反應(yīng)一般可在

    60 min內(nèi)將靶基因由幾個拷貝擴(kuò)增至109~1010數(shù)量級水平,若再引入兩條環(huán)引物(LF/LB),時間可以進(jìn)一步縮短1/3~1/2。而傳統(tǒng)的PCR方法因?yàn)橛凶儚?fù)性、升降溫的過程,反應(yīng)一般在90 min以上。

    2.4 操作簡便

    因?yàn)榉磻?yīng)過程中無須進(jìn)行變復(fù)性溫度循環(huán),大大縮短了檢測時間,恒溫條件下即可進(jìn)行擴(kuò)增。所有反應(yīng)試劑可進(jìn)行預(yù)混并分裝凍存,檢測時只需加入待檢樣品,混合均勻,置于水浴鍋中孵育一定時間,即可實(shí)現(xiàn)快速鑒定。

    2.5 一步擴(kuò)增RNA

    只要在原有試劑的基礎(chǔ)上加入逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑,就能夠完全像DNA基因擴(kuò)增那樣,一步實(shí)現(xiàn)RNA的擴(kuò)增,將逆轉(zhuǎn)錄過程和擴(kuò)增過程在同一個反應(yīng)管中完成[8]。

    3 技術(shù)應(yīng)用

    3.1 在細(xì)菌性疾病檢測中的應(yīng)用

    3.1.1 產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的檢測。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shinga Toxin-producing Escherichia Coli,STEC)是引起仔豬水腫病的重要病原,由某些血清型溶血性大腸桿菌產(chǎn)生。馮瑜菲[9]等參照GenBank中登陸的基因序列,針對其保守區(qū)域(Stx2e基因)使用在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4設(shè)計了特異性LAMP引物,利用煮沸法提取模板,分別進(jìn)行PCR和LAMP擴(kuò)增對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,LAMP檢測模板的最低檢測限為3.8×101cfu/管,而PCR方法的最低檢測限為3.8×103cfu/管,LAMP方法的靈敏性是PCR方法的100倍。模擬樣品的檢測結(jié)果提示,兩者的檢出率都是40%,符合率為100%。

    3.1.2 布魯氏菌的檢測。布魯氏菌?。˙rucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人畜共患傳染病,可引起流產(chǎn)、不孕和各種組織的局部病灶。本病廣泛分布于世界各地,家畜中以豬、牛、羊最易發(fā)病,給畜牧業(yè)和一線獸醫(yī)工作人員帶來嚴(yán)重危害。目前,布魯氏菌病診斷技術(shù)主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、乳環(huán)試驗(yàn)(MRT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法。許鄒亮[10]等針對布魯氏菌外膜蛋白OMP25基因保守區(qū)設(shè)計6條引物,于反應(yīng)前將羥基萘酚藍(lán)(HNB)染料加入體系中作為LAMP擴(kuò)增的指示劑,在水浴鍋中63 ℃反應(yīng)60 min即可通過HNB顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定。該方法特異性良好,對大腸桿菌K99、巴氏桿菌C48-1、豬鏈球菌ST171、綠膿桿菌等對照組均未見擴(kuò)增。針對60份RBT檢測陽性血清的平行檢測結(jié)果顯示,LAMP和B4/ B5-PCR這兩種方法檢測的結(jié)果符合率為85.0%。LAMP的最低檢測限可達(dá)17 fg,敏感性高于B4/ B5-PCR方法100~1 000倍,達(dá)到甚至高于熒光定量PCR檢測水平。

    3.2 在病毒性疾病檢測中的應(yīng)用

    3.2.1 DNA病毒的檢測

    3.2.1.1 豬細(xì)小病毒的檢測。豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)屬于細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒屬成員。造成母豬的繁殖障礙并可感染胚胎,導(dǎo)致胎兒死亡、流產(chǎn)。PPV分布廣泛,能在外界環(huán)境中長期存活并對大部分化學(xué)消毒劑不敏感。常規(guī)的分子生物學(xué)病原檢測方法有血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、ELISA、PCR等,但是存在著這樣或那樣的問題。劉業(yè)兵[11]等選用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320型濁度儀對LAMP反應(yīng)情況進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測,分析反應(yīng)進(jìn)程,篩選到可靠、最佳的反應(yīng)體系,建立針對PPV病原的快速、特異的LAMP檢測方法。利用實(shí)時濁度儀建立的PPV LAMP反應(yīng)體系的結(jié)果與肉眼可視化判定的結(jié)果完全一致,提示其高度的可靠性與穩(wěn)定性,同時為該技術(shù)的臨床推廣應(yīng)用提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

    3.2.1.2 鴨瘟病毒的檢測。鴨瘟(Duck plague,DP)是由鴨瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起鴨、鵝等水禽的一種急性敗血性傳染病,其特征是流行廣泛,傳播迅速,發(fā)病率和死亡率高,嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。張坤[12]等建立的LAMP檢測方法,敏感性可達(dá)0.245 μg/L,比普通PCR方法靈敏性高10倍,而且對鴨病毒性肝炎、H9N2亞型禽流感病毒、鴨副粘病毒、鴨源偏肺病毒等常見

    病毒的核酸無交叉反應(yīng)。對40份臨床樣品的陽性檢出率為30%。表明該方法簡便快捷,省時省力,是一種適用于基層實(shí)驗(yàn)室的快速、準(zhǔn)確檢測DPV的方法。

    3.2.2 RNA病毒的檢測

    3.2.2.1 豬瘟病毒的檢測。豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由黃病毒科,瘟病毒屬的豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種以高傳染性和高死亡率為特征的疾病,對養(yǎng)豬業(yè)造成極大地?fù)p失。常規(guī)的檢測方法難以區(qū)分豬瘟野毒株和疫苗株,張改平[13]等利用一步法RT-PCR的思路,將核酸的逆轉(zhuǎn)錄過程與擴(kuò)增過程相結(jié)合,采用RT-LAMP的方法,通過比對野毒株和疫苗株的不同基因,選取NS5B基因上一段差異較大的序列,設(shè)計了兩組特異性的引物,成功的使用簡單快捷的方法將兩者進(jìn)行區(qū)分。經(jīng)測試,該方法靈敏度超出常規(guī)RT-PCR 1 000倍以上,且重復(fù)性、穩(wěn)定性良好,為我國豬瘟防控與凈化提供了技術(shù)支持。

    3.2.2.2 新城疫病毒的檢測。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一類主要感染禽類的烈性傳染病,是我國重點(diǎn)防控的重大動物疫病。陳兵[14]等選取新城疫病毒融合蛋白基因(F基因)設(shè)計了1對特異性的引物,并將目的片段導(dǎo)入pMD18-T Vector成功構(gòu)建pMD18-T-F重組質(zhì)粒,并以此為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)。在制備反應(yīng)液時,先將0.5 μL SYBR Green Ⅰ染料小心加入反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè),于反應(yīng)結(jié)束后輕輕顛倒反應(yīng)管數(shù)次,以使染料混入,觀察顏色變化,可以有效地避免因開蓋造成的污染問題。田間樣品檢測結(jié)果顯示,20份樣品中特異性檢出NDV陽性4份,陰性16份,與實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果完全一致。

    3.3 在支原體疾病檢測中的應(yīng)用

    3.3.1 豬肺炎支原體的檢測。豬氣喘病又稱豬支原體肺炎,是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mh)引起的一種慢性接觸性呼吸道傳染病。支原體可通過空氣傳播,很難隔離和阻斷其傳播途徑,嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。李鵬[15]等使用Oligo6.71軟件設(shè)計了4條引物,成功建立了一種快速、簡便、可靠的豬肺炎支原體檢測方法。優(yōu)化后的擴(kuò)增反應(yīng)條件為60 ℃孵育60 min,最低檢測限可達(dá)到3個拷貝。對多殺性巴氏桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、肺炎雙球菌、支氣管敗血波氏桿菌、副豬嗜血桿菌和鏈球菌的檢測結(jié)果均為陰性,表明該方法特異性良好。與常規(guī)PCR方法相比,LAMP法大大縮短了檢測時間,且能夠特異性鑒別豬肺炎支原體。

    3.3.2 雞滑液支原體的檢測。滑液支原體(Mycoplasma synoviae,MS)以侵害雞關(guān)節(jié)滑液、腱鞘膜和氣囊為主,引起雞亞臨床型的上呼吸道感染和關(guān)節(jié)滑液囊炎。鄧顯文[16]等對LAMP和PCR的靈敏度、反應(yīng)條件和產(chǎn)物檢測進(jìn)行了對比,發(fā)現(xiàn)LAMP的靈敏度是PCR的10倍,并且簡便易行,成本低廉,比其他基于PCR的方法更適合MS的檢測。為了防止假陽性的出現(xiàn),實(shí)驗(yàn)操作過程中將配置反應(yīng)體系的區(qū)域、加樣區(qū)域和結(jié)果觀察區(qū)域進(jìn)行嚴(yán)格分區(qū)。同時,使用Calcein+MnCl2替代SYBR GreenⅠ和Gene Finder,在配置反應(yīng)液時就加入其中,避免了常規(guī)LAMP方法需要在反應(yīng)后加入染料顯色容易造成污染的問題。

    4 不足之處

    LAMP方法建立時間還不長,不可避免地存在著一些缺點(diǎn)和不足,例如:檢測結(jié)果只有陽性與陰性兩種,只能定性不能定量,一旦產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,不易鑒別。靶序列長度只能控制在300 bp以內(nèi),不適合長片段的擴(kuò)增。采用了多條引物,而且是在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增,引物之間可能形成互補(bǔ)而擴(kuò)增出非特異性的條帶,造成假陽性[18]。

    5 前景展望

    LAMP檢測方法在動物病原檢測上具有廣闊的應(yīng)用前景,有常規(guī)PCR方法無可比擬的優(yōu)勢:LAMP的整個擴(kuò)增過程均在恒溫條件下進(jìn)行,規(guī)避了常規(guī)PCR對于溫度升降的步驟,不僅不要使用昂貴的儀器設(shè)備,同時也大大縮短了反應(yīng)時間,更加符合基層獸醫(yī)站和臨床一線對快速診斷的需要。反應(yīng)副產(chǎn)物——焦磷酸鎂形成的渾濁度使得反應(yīng)結(jié)

    果更加容易觀察和判定。由于該方法的簡便易行,該技術(shù)有望在基層檢測中大面積推廣。

    [1] 陳鍇,姚華偉,王長江,等. 熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗(yàn)替代方法的研究與應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(1):162-169.

    [2] 曲光剛,楊慧,唐娜,等. 豬瘟病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立和應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2010(15):121-123.

    [3] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al . Loopmediated isothermal amplification of DNA [J] Nucleic Acids Research,2000,28 (12):E63.

    [4] Soliman H, Saleh M, El-Matbouli M.Detection of Fish Pathogens by Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP) Technique [J]. Methods Mol Biol.2015,1247:163-173.

    [5] 李啟明,馬學(xué)軍,周蕊,等.環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因檢測中的應(yīng)用[J]. 病毒學(xué)報,2006(5):334-338.

    [6] 匡燕云,李思光,羅玉萍. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增核酸技術(shù)及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報,2007(3):557-560.

    [7] Liu J, Nian Q G, Li J,et al. Development of reversetranscription loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of novel avian influenza A (H7N9) virus [J]. BMC Microbiology. 2014,14(1):271.

    [8] 秦智鋒,曾少靈,阮周曦,等.口蹄疫病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2008(5):375-378.

    [9] 馮瑜菲,朱穎,劉文鑫,等.產(chǎn)志賀毒素Ⅱ型變異體大腸桿菌LAMP檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2011(3):287-291.

    [10] 許鄒亮,南文龍,周潔,等.布魯氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)可視化檢測方法的建立[J].中國動物檢疫,2011,28(8):37-40.

    [11] 劉業(yè)兵,張磊,寧宜寶,等. 豬細(xì)小病毒LAMP檢測方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,14:3012-3018.

    [12] 張坤,刁有祥,鞠小軍.鴨瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2013(4):520-525.

    [13] 張改平,何文博,王德國,等.豬瘟強(qiáng)毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版),2014(3):85-90.

    [14] 陳兵,胡運(yùn)發(fā),孫潔,等.新城疫病毒實(shí)時熒光RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014(7):11-14.

    [15] 李鵬,馬艷嬌,于劍,等.豬肺炎支原體環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立[J].中國生物制品學(xué)雜志,2011(4):480-483.

    [16] 鄧顯文,謝芝勛,謝志勤,等.雞滑液支原體LAMP快速可視化檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2014(1):46-49.

    [17] 陳伯祥,楊明,常亮,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在動物傳染病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012(4):90-96.

    Loop-mediated Isothermal Amplif cation and Its Application in Animal Disease Diagnosis

    Hu Cheng1,Cheng Darong1,Yu Shupei1,Zhao Fang1,Su Lingling1,Cai Shudong1,Gu Lingling1,WangYongjuan2
    (1. College of Veterinary Medicine,Yangzhou University Yangzhou,225009,China;2. Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary college,Taizhou,225300,China)

    The loop-mediated isothermal amplification(LAMP)is a new nucleic acid amplification method. Due to its high specificity,efficiency,simplicity,rapidity and cheapness,more and more veterinarians focus on the method. At present,LAMP has been widely used in detecting various pathogens. In this review,the principle,process and application of LAMP were introduced,its short-comings were pointed out and the future development in animal disease diagnosis was prospected in order to provide theoretical basis for clinical application.

    loop-mediated isothermal amplification;animal disease diagnosis;application

    S854.4

    A

    1005-944X(2015)04-0046-05

    江蘇省博士后科研資助計劃項(xiàng)目(1401077B);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302096);江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院2014年度重點(diǎn)支持項(xiàng)目(NSFZD1405);揚(yáng)州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司橫向合作項(xiàng)目(00010114012)。

    成大榮

    猜你喜歡
    等溫支原體特異性
    EPDM/PP基TPV非等溫結(jié)晶行為的研究
    藏羊支原體肺炎的診斷與治療
    豬支原體肺炎的診斷與防治
    精確制導(dǎo) 特異性溶栓
    反復(fù)發(fā)燒、咳嗽,都是肺炎支原體惹的禍
    媽媽寶寶(2017年3期)2017-02-21 01:22:14
    雞敗血支原體病的診治
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    快速檢測豬鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法
    重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
    納米CaCO3對FEP非等溫結(jié)晶動力學(xué)的影響
    中國塑料(2015年3期)2015-11-27 03:41:54
    亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 午夜福利视频1000在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 麻豆一二三区av精品| 网址你懂的国产日韩在线| 中文欧美无线码| 99久久精品热视频| 舔av片在线| 简卡轻食公司| 国产精品久久久久久久久免| av在线亚洲专区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 日韩大片免费观看网站 | 青春草国产在线视频| 成人美女网站在线观看视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品一区二区免费观看| av国产久精品久网站免费入址| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 美女被艹到高潮喷水动态| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久韩国三级中文字幕| 99久久人妻综合| 99久久精品一区二区三区| 黄色一级大片看看| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品日韩av片在线观看| 岛国在线免费视频观看| 老司机福利观看| 日韩成人伦理影院| 日韩欧美精品v在线| or卡值多少钱| 久久草成人影院| 亚洲性久久影院| 2022亚洲国产成人精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 三级国产精品片| 看片在线看免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久久久久久久黄片| 1024手机看黄色片| 日本一本二区三区精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品色激情综合| 日韩欧美精品免费久久| 国产成人精品一,二区| 熟女电影av网| 久久久久久久久久黄片| 乱系列少妇在线播放| 免费人成在线观看视频色| 国产极品精品免费视频能看的| 久久久久久久久大av| 美女内射精品一级片tv| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99热网站在线观看| 一本久久精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩强制内射视频| 久久人人爽人人片av| 久久久欧美国产精品| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲国产欧美人成| 国产视频内射| 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩在线观看h| 日韩强制内射视频| 国产69精品久久久久777片| 国产伦一二天堂av在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 岛国在线免费视频观看| 国产综合懂色| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产黄a三级三级三级人| av女优亚洲男人天堂| 精品国内亚洲2022精品成人| av在线观看视频网站免费| 国产不卡一卡二| 亚洲国产精品成人综合色| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产毛片a区久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| av视频在线观看入口| 欧美另类亚洲清纯唯美| 全区人妻精品视频| 亚洲国产欧美人成| 如何舔出高潮| 日本免费在线观看一区| 97在线视频观看| 免费在线观看成人毛片| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久99热这里只频精品6学生 | 神马国产精品三级电影在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 午夜激情福利司机影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲av福利一区| 水蜜桃什么品种好| a级一级毛片免费在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇的逼好多水| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产综合懂色| 国产黄片美女视频| www.色视频.com| 一本久久精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品一区二区免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 在线播放无遮挡| 亚洲成人中文字幕在线播放| 春色校园在线视频观看| 日韩成人伦理影院| 亚洲综合色惰| a级毛色黄片| 九草在线视频观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 好男人在线观看高清免费视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 老司机影院成人| 看片在线看免费视频| 日本与韩国留学比较| 91在线精品国自产拍蜜月| av线在线观看网站| 国产三级中文精品| 亚洲av熟女| 99久久人妻综合| 大话2 男鬼变身卡| 久久久精品94久久精品| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久久久久大精品| 亚洲不卡免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品久久久久久久久av| 亚洲人成网站在线播| 国产高清不卡午夜福利| 男女国产视频网站| 国产91av在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 高清av免费在线| 少妇熟女欧美另类| .国产精品久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 91精品国产九色| 亚洲成人av在线免费| 欧美精品国产亚洲| 久久草成人影院| 欧美区成人在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品酒店卫生间| 在线免费观看的www视频| 三级毛片av免费| 国产精品乱码一区二三区的特点| 色吧在线观看| 一级av片app| av福利片在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲av不卡在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲内射少妇av| 免费看日本二区| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜精品国产一区二区电影 | 日本三级黄在线观看| av在线蜜桃| 国产精品女同一区二区软件| 十八禁国产超污无遮挡网站| 成人三级黄色视频| 好男人在线观看高清免费视频| 国产午夜精品论理片| 亚洲美女视频黄频| 国产乱来视频区| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 又爽又黄无遮挡网站| 在线a可以看的网站| 久久久精品94久久精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 男的添女的下面高潮视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产成人精品一,二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久久中文| 精品国产三级普通话版| 久久精品国产亚洲网站| 熟女电影av网| 成人午夜高清在线视频| 麻豆一二三区av精品| 国产不卡一卡二| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲色图av天堂| 九色成人免费人妻av| 国产精品伦人一区二区| 精品熟女少妇av免费看| 日韩av在线大香蕉| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久伊人网av| 秋霞在线观看毛片| 国内精品美女久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 99久久成人亚洲精品观看| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品国产av成人精品| 久久亚洲国产成人精品v| 国产成人免费观看mmmm| 最近手机中文字幕大全| 亚洲在线观看片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美3d第一页| 国产成年人精品一区二区| 成年免费大片在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 看免费成人av毛片| 中文字幕熟女人妻在线| 99热这里只有是精品50| 亚洲欧洲国产日韩| 韩国高清视频一区二区三区| 大话2 男鬼变身卡| 丰满少妇做爰视频| 伦理电影大哥的女人| 少妇的逼好多水| 久久久久久久国产电影| 2021天堂中文幕一二区在线观| 性插视频无遮挡在线免费观看| 看黄色毛片网站| 亚洲伊人久久精品综合 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产私拍福利视频在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 成人美女网站在线观看视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 少妇人妻精品综合一区二区| 1000部很黄的大片| 亚洲综合精品二区| 少妇高潮的动态图| 日韩成人av中文字幕在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 热99在线观看视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久久久久久午夜电影| 成人美女网站在线观看视频| 色吧在线观看| 国产精品永久免费网站| eeuss影院久久| 老司机影院成人| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 如何舔出高潮| 亚洲成人精品中文字幕电影| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产老妇女一区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品永久免费网站| 最新中文字幕久久久久| 久久久国产成人精品二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美成人a在线观看| 国产午夜精品论理片| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品一区二区性色av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 日本熟妇午夜| 久久精品综合一区二区三区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久综合国产亚洲精品| av专区在线播放| 国产精品一及| 午夜精品国产一区二区电影 | 精品国内亚洲2022精品成人| 精品午夜福利在线看| 九九爱精品视频在线观看| 免费看a级黄色片| 麻豆成人午夜福利视频| 国产免费一级a男人的天堂| 久久午夜福利片| 内射极品少妇av片p| 成年女人永久免费观看视频| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品乱久久久久久| 国产乱人偷精品视频| 美女大奶头视频| 最近的中文字幕免费完整| 高清午夜精品一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 日本熟妇午夜| a级毛片免费高清观看在线播放| 天堂网av新在线| 草草在线视频免费看| 国产精品久久久久久久久免| 哪个播放器可以免费观看大片| 午夜激情欧美在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美清纯卡通| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 好男人视频免费观看在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 秋霞伦理黄片| 国产黄a三级三级三级人| av在线老鸭窝| 日韩欧美三级三区| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲怡红院男人天堂| 中文字幕亚洲精品专区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | www.色视频.com| 精品久久久久久成人av| 久久精品国产自在天天线| 国产亚洲一区二区精品| 国产精品国产三级专区第一集| 国产片特级美女逼逼视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久韩国三级中文字幕| .国产精品久久| 久久韩国三级中文字幕| .国产精品久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一级二级三级毛片免费看| 成人午夜精彩视频在线观看| 综合色av麻豆| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 97超碰精品成人国产| 久久久久久国产a免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久久国产a免费观看| 国产淫语在线视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 日韩视频在线欧美| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品无大码| 亚洲最大成人手机在线| 看免费成人av毛片| 成年女人永久免费观看视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 九色成人免费人妻av| 成人美女网站在线观看视频| 欧美精品国产亚洲| 国产精品野战在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 超碰97精品在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品一区www在线观看| 波野结衣二区三区在线| 欧美一区二区亚洲| 高清视频免费观看一区二区 | 韩国高清视频一区二区三区| 91av网一区二区| 免费看av在线观看网站| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久亚洲精品不卡| 直男gayav资源| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲人成网站在线播| 亚洲欧洲国产日韩| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久精品影院6| 欧美97在线视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩视频在线欧美| 男女国产视频网站| 91狼人影院| 久久综合国产亚洲精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 99国产精品一区二区蜜桃av| 在线观看66精品国产| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产极品精品免费视频能看的| 中文字幕免费在线视频6| 午夜a级毛片| 精品久久久久久成人av| 亚洲av.av天堂| 国产一区有黄有色的免费视频 | www.色视频.com| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 一级爰片在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产视频首页在线观看| 日韩成人伦理影院| 一夜夜www| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 插逼视频在线观看| 亚洲四区av| 国产免费一级a男人的天堂| 国产美女午夜福利| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品伦人一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 中文在线观看免费www的网站| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产成人福利小说| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本爱情动作片www.在线观看| 黄色配什么色好看| 插阴视频在线观看视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 青春草国产在线视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 99久久精品热视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲最大成人手机在线| 色网站视频免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品久久久久久久久av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩 亚洲 欧美在线| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 天美传媒精品一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99久久成人亚洲精品观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 女人被狂操c到高潮| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品人妻久久久久久| 我要搜黄色片| .国产精品久久| 在现免费观看毛片| 午夜日本视频在线| 中文字幕亚洲精品专区| 亚州av有码| 国产精品野战在线观看| 久久99热这里只频精品6学生 | 校园人妻丝袜中文字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 麻豆成人午夜福利视频| 精品人妻视频免费看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品一区二区三区四区久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 六月丁香七月| 男的添女的下面高潮视频| 欧美丝袜亚洲另类| 久久这里只有精品中国| 99热精品在线国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 26uuu在线亚洲综合色| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美人与善性xxx| 精品久久久久久久末码| 一个人看的www免费观看视频| 久久韩国三级中文字幕| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| av专区在线播放| 国国产精品蜜臀av免费| 美女被艹到高潮喷水动态| 丰满人妻一区二区三区视频av| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产亚洲一区二区精品| 中文天堂在线官网| 久久久国产成人免费| 永久网站在线| 日本欧美国产在线视频| 人体艺术视频欧美日本| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 色综合色国产| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲欧美日韩东京热| 我要搜黄色片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 69人妻影院| 看免费成人av毛片| 免费搜索国产男女视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人a∨麻豆精品| 国产毛片a区久久久久| 国内精品宾馆在线| 欧美日韩在线观看h| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩强制内射视频| 免费av不卡在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 99热精品在线国产| av视频在线观看入口| 波野结衣二区三区在线| 一区二区三区免费毛片| 欧美区成人在线视频| 老司机影院成人| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产综合懂色| 青青草视频在线视频观看| 全区人妻精品视频| 欧美丝袜亚洲另类| 国产精品久久久久久精品电影| 国产在线男女| 久久午夜福利片| 国产三级中文精品| 国产乱人偷精品视频| 九九热线精品视视频播放| 女人久久www免费人成看片 | av国产免费在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 嫩草影院新地址| 国产极品精品免费视频能看的| 久久久国产成人精品二区| 久久久久久久久久黄片| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲最大成人手机在线| 91av网一区二区| 日韩视频在线欧美| 亚洲av熟女| ponron亚洲| 精品久久久久久成人av| 亚洲怡红院男人天堂| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 97超视频在线观看视频| 亚洲无线观看免费| 99久国产av精品国产电影| 哪个播放器可以免费观看大片| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 两个人视频免费观看高清| av在线蜜桃| 久久久久久久国产电影| 欧美一区二区国产精品久久精品| av天堂中文字幕网| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 搞女人的毛片| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲精品成人久久久久久| 国产淫语在线视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲精品,欧美精品| 男女那种视频在线观看| 亚洲av一区综合| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美成人精品欧美一级黄| 九色成人免费人妻av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 日本三级黄在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 久久精品91蜜桃| 极品教师在线视频| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美区成人在线视频| 国产单亲对白刺激| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲经典国产精华液单| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日本与韩国留学比较| 亚洲人成网站高清观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 寂寞人妻少妇视频99o| 午夜精品国产一区二区电影 | 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品一二三区在线看| 黑人高潮一二区| 伦理电影大哥的女人| 日本一二三区视频观看| 美女大奶头视频| 午夜视频国产福利| 男人的好看免费观看在线视频| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲人成网站在线观看播放| 男人的好看免费观看在线视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲精品国产av成人精品| 黄片wwwwww| 久久亚洲国产成人精品v| 99在线视频只有这里精品首页| 日本wwww免费看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 简卡轻食公司|