鴨H5亞型高致病性禽流感疫苗研究進(jìn)展及其效率影響因素

蔣文明，陳繼明

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

鴨H5亞型高致病性禽流感疫苗研究進(jìn)展及其效率影響因素

蔣文明，陳繼明

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

鴨在H5亞型高致病性禽流感的流行中發(fā)揮重要作用，成功控制鴨H5亞型高致病性禽流感對(duì)根除該病在家禽中的流行和人類健康具有重要的意義。本文對(duì)當(dāng)前鴨H5亞型高致病性禽流感疫苗使用和研究進(jìn)展，以及影響疫苗效率的因素（疫苗類型、鴨的品種、免疫程序、疫苗的抗原匹配性、佐劑、免疫覆蓋率）進(jìn)行了綜述。

鴨；高致病性禽流感；H5；免疫接種

水禽是禽流感病毒（Avian influenza Virus，AI）的主要天然儲(chǔ)存庫(kù)。大多數(shù)的禽流感病毒可以通過自然或試驗(yàn)感染鴨，包括高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV），然而，目前關(guān)于鴨對(duì)AIV感染后免疫反應(yīng)的知識(shí)仍十分有限。H5 HPAIV對(duì)鴨致病性的差異會(huì)直接影響到對(duì)該病的監(jiān)測(cè)和控制，因?yàn)槿藗兒茈y識(shí)別那些無癥狀或輕微癥狀的感染鴨，導(dǎo)致病毒傳播到其它易感家禽，并可能威脅到人類健康。

考慮到H5 HPAIV在世界某些地區(qū)的水禽中廣泛存在，因此，為控制H5 HPAIV的傳播，降低鴨感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。在有效控制H5 HPAI措施中，除了生物安全措施，免疫接種是一個(gè)可以幫助控制H5 HPAI的有力工具。

1　鴨H5 HPAI疫苗研究進(jìn)展

臨床上，鴨使用的大多數(shù)疫苗是用自然分離的或反向遺傳產(chǎn)生的低致病性禽流感病毒制備的油乳劑滅活疫苗。在預(yù)防和控制家禽H5 HPAI方面，傳統(tǒng)的滅活疫苗是有效的。然而，疫情仍然在家鴨中不斷發(fā)生。2014年以來，英國(guó)、韓國(guó)、日本、美國(guó)、中國(guó)等多個(gè)國(guó)家相繼發(fā)生鴨H5亞型禽流感疫情。免疫接種的一個(gè)新途徑是使用新型病毒載體疫苗，如痘病毒載體，它在北京鴨和番鴨上表現(xiàn)出良好的免疫原性，而且還可以進(jìn)行1日齡接種［1］。

除了痘病毒疫苗，新型疫苗如鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）或新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）載體疫苗，也在鴨上進(jìn)行了評(píng)估試驗(yàn)。Liu等［2］將H5N1病毒的HA基因插入DEV基因組中，構(gòu)建了重組病毒。鴨免疫攻毒試驗(yàn)表明，重組體與DEV活疫苗有類似的保護(hù)效果，單一劑量免疫3天后就可以誘導(dǎo)針對(duì)致死DEV攻毒和致死H5N1 HPAIV攻毒的完全保護(hù)。結(jié)果表明，重組DEV適用于雙價(jià)弱毒活疫苗，可以快速和完全保護(hù)鴨免受DEV和H5N1 HPAIV的攻擊。

2006年以來，我國(guó)開發(fā)了表達(dá)H5N1禽流感病毒HA基因的重組雞NDV，制作NDV和H5N1病毒的雙價(jià)疫苗［3］。Ferreira等［4］的一項(xiàng)研究表明，重組NDV疫苗可以誘導(dǎo)11日齡的騾鴨產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，H5N1 HPAI攻毒后可以獲得完全的臨床保護(hù)。但是，也發(fā)現(xiàn)母源抗體會(huì)抑制機(jī)體對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)。

1.2標(biāo)記疫苗

為區(qū)分免疫鴨與感染鴨，應(yīng)當(dāng)考慮在血清學(xué)監(jiān)測(cè)中使用DIVA（Differentiation of Infected from Vaccinated Animals）策略。一種方法是在疫苗中加入外源抗原，用作免疫接種的陽(yáng)性標(biāo)記，如使用破傷風(fēng)類毒素（TT）標(biāo)記的H6N2禽流感疫苗［5］。兩次免疫后，可以產(chǎn)生高滴度的TT特異性抗體，并可以維持19個(gè)周。滅活H6N2疫苗插入TT后，沒有干擾H6或TT的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)，表明TT可能是一個(gè)高度適合的鴨禽流感疫苗的外源標(biāo)記?；诒磉_(dá)H5 HA抗原的重組桿狀病毒亞單位禽流感病毒疫苗和帶有標(biāo)記抗原（TT）的滅活H5N2禽流感疫苗，可以保護(hù)幼鴨。

2　影響鴨疫苗效率的因素

影響鴨H5 HPAIV疫苗效率的因素很多，包括疫苗類型、鴨的品種、免疫接種程序（接種日齡、接種劑量、有效HA抗原量）、攻毒病毒以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境等。針對(duì)這些因素的研究和提高對(duì)H5 HPAI的控制有著重要意義。在大多數(shù)情況下，接種疫苗的鴨子可以獲得保護(hù)和減少排毒。如果疫苗與流行毒的抗原性匹配良好，免疫方法正確，免疫禽群的排毒量會(huì)大大降低，不足以感染接種或未接種疫苗的禽類。

2.1疫苗類型

臨床上，家鴨使用的大多數(shù)疫苗是油乳劑滅活疫苗。由反向遺傳生產(chǎn)的滅活疫苗Re-1，含有A/ goose/Guangdong/1/96 （H5N1）的NA基因和修飾的HA基因，能夠保護(hù)鴨不出現(xiàn)臨床癥狀，并減少排毒。Re-1疫苗誘導(dǎo)北京幼鴨和番鴨產(chǎn)生低水平到中等水平的抗體滴度，免疫2周后攻毒可以保護(hù)它們不發(fā)病，但不能阻止排毒。研究結(jié)果表明，單一疫苗接種劑量不足以減少H5N1 HPAIV的傳播，因此，加強(qiáng)免疫接種是必需的。Van der Goot等［6］的一項(xiàng)研究也證明鴨接種兩次全病毒滅活疫苗可以獲得更好的保護(hù)。

在人生廣大的倒影里，原沒有雌雄之別，千頃山河如鏡，山色在有無之間，使我想起南方故鄉(xiāng)的太陽(yáng)雨，最愛的是末兩句：“一點(diǎn)浩然氣，千里快哉風(fēng)！”心里存有浩然之氣的人，千里的風(fēng)都不亦快哉，為他飛舞，為他鼓掌！

2.2鴨的品種

北京鴨是H5N1 HPAI疫苗效率評(píng)估研究中使用較多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其它如美洲家鴨、麻鴨、騾鴨、綠頭鴨則相對(duì)較少。不同品種的鴨對(duì)免疫接種的應(yīng)答不同，因此試驗(yàn)條件不相同時(shí)很難對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。使用禽痘病毒載體疫苗研究顯示，北京鴨和番鴨對(duì)疫苗接種存在差異。免疫番鴨的排毒期可長(zhǎng)達(dá)19天，而北京鴨在任何時(shí)間點(diǎn)都沒有檢測(cè)到排毒。

當(dāng)感染H5N1 HPAIV時(shí)，番鴨比其他品種的鴨，如北京鴨、綠頭鴨、康貝爾鴨等表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀，騾鴨似乎也比番鴨更耐受H5N1病毒感染，表明它們?cè)谙忍煨悦庖邞?yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面存在差異。因此，在實(shí)踐中應(yīng)當(dāng)考慮不同種類的鴨子對(duì)H5N1 HPAIV的致病性不同和對(duì)免疫接種的應(yīng)答差異。不管滅活疫苗還是活疫苗，都應(yīng)當(dāng)特別關(guān)注番鴨，可能需要更多的加強(qiáng)免疫才能獲得與其他鴨子相同水平的保護(hù)。

2.3免疫接種程序

為了探索更有效的接種方法，研究者在北京鴨和番鴨上分別試驗(yàn)了三種不同的免疫程序，前兩種方法是在1天和14天或7天和21天接種兩個(gè)劑量的疫苗，第三個(gè)程序是在14天時(shí)接種一個(gè)劑量的疫苗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7天和21天時(shí)接種能獲得最好的保護(hù)［7］。原因可能是7天時(shí)鴨子體內(nèi)的母源抗體會(huì)降低，免疫系統(tǒng)也趨于成熟，所以此時(shí)的免疫反應(yīng)較好。在1天時(shí)免疫2個(gè)劑量的疫苗，雖然只產(chǎn)生較低的抗體反應(yīng)，但免疫鴨沒有發(fā)病和死亡。

在北京鴨上使用全病毒滅活疫苗和/或禽痘重組病毒疫苗，評(píng)估不同免疫接種程序的效率［8］。研究表明，多種試驗(yàn)的免疫接種程序都可以提供完全的保護(hù)，沒有出現(xiàn)臨床癥狀和排毒。然而，禽痘病毒載體疫苗首免、滅活疫苗加強(qiáng)免疫的鴨子，誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答最廣，表明這種首免-加強(qiáng)免疫的策略可以誘導(dǎo)針對(duì)H5的最佳免疫力。此外，該免疫接種程序在1日齡試驗(yàn)鴨上也能誘導(dǎo)很好的免疫力。

2.4疫苗和攻毒病毒之間的同源性

HA蛋白序列決定了病毒與疫苗之間的同源性。雖然遺傳和抗原距離之間有一定相關(guān)性，但也有可能僅僅一個(gè)氨基酸導(dǎo)致的特定遺傳差異就會(huì)導(dǎo)致抗原性的明顯不同［9］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)流感的抗原距離與HI滴度的對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)，這一理論是構(gòu)建抗原圖譜的基礎(chǔ)。HI試驗(yàn)中當(dāng)抗原差異2個(gè)以上滴度時(shí)，人流感疫苗就需要更新。因?yàn)榍莺腿祟愒诿庖呓臃N中有很多差異，還不清楚這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是否適用于禽流感疫苗。

大多數(shù)疫苗研究中使用的疫苗，與攻毒病毒都有較高的同源性。對(duì)遺傳距離較大疫苗的有效性研究較少。Beato等［10］使用H5N2病毒制備的疫苗，與H5N1攻毒病毒HA1蛋白同源性為89%，攻毒后沒有分離到任何病毒。另一項(xiàng)研究中使用H5N2疫苗株，其HA1蛋白與攻毒的H5N1 HPAIV同源性為84%，鴨免疫2周后不僅防止嚴(yán)重的發(fā)病和死亡出現(xiàn)，也顯著減少了排毒和傳播［11］。由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)、疫苗、攻毒病毒不同，從這些研究中很難得出明確的結(jié)論。當(dāng)前在雞上使用疫苗的情況表明同源疫苗免疫可以獲得最好的效果，疫苗與攻毒毒株的距離越遠(yuǎn)，保護(hù)效果越差。在鴨上接種疫苗也可能出現(xiàn)這種情況。

2.5佐劑

高效的疫苗不僅需要良好的抗原，也需要良好的佐劑來增強(qiáng)抗原的免疫原性。目前已經(jīng)開發(fā)了多種禽流感疫苗，并在雞上進(jìn)行了優(yōu)化，但在鴨子上可能還不是最優(yōu)的。使用三種不同的佐劑（礦物油、Montanide ISA 70M VG、Montanide ISA 206 VG）制備疫苗，免疫SPF鴨和雞，發(fā)現(xiàn)三種佐劑誘導(dǎo)的抗體滴度水平相當(dāng)。

另一種增強(qiáng)疫苗免疫原性的方法，是在疫苗中使用細(xì)胞因子等免疫刺激分子。Qian等［12］構(gòu)建了一個(gè)共同表達(dá)H5N1 HPAIV的HA基因和雞IL-6基因的重組禽痘病毒（rFPV-AIH5AIL6），并在鴨上評(píng)估其免疫反應(yīng)。與單純表達(dá)HA基因的重組禽痘病毒疫苗相比，rFPV-AIH5AIL6疫苗可誘導(dǎo)更高的抗AIV HI抗體反應(yīng)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，免疫保護(hù)效果更好。雞IL-6可能是一個(gè)有效的佐劑，增強(qiáng)了禽痘病毒載體AIV疫苗在鴨上的免疫原性。Yao等［13］構(gòu)建了編碼H5亞型HA與CD154（CD40L）融合的嵌合蛋白DNA疫苗，并在北京鴨上評(píng)估其免疫原性和保護(hù)效果。該疫苗可以誘導(dǎo)針對(duì)不同遺傳譜系的H5 HPAIV的保護(hù)，但也存在一些缺陷，如需要多個(gè)劑量的免疫，因此目前還不適用于臨床使用。一些方法可以改善疫苗的免疫應(yīng)答，如當(dāng)番鴨免疫重組禽流感H5滅活病毒疫苗時(shí)，同時(shí)飼喂蘇菲葡聚糖（一種增強(qiáng)免疫應(yīng)答的多糖），也可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

2.6免疫覆蓋率

對(duì)于H5 HPAI的防控，充分接種足夠數(shù)量的鴨子來維持“群體免疫力”是必需的。當(dāng)免疫鴨不能限制在一個(gè)生物安全的位置時(shí)，問題就變得復(fù)雜。一些國(guó)家經(jīng)常在沒有生物安全措施的開放水域飼養(yǎng)鴨，導(dǎo)致H5 HPAI的疫苗接種覆蓋率較差，因此大量的鴨子對(duì)病毒易感，可以作為病毒儲(chǔ)存庫(kù)傳播H5 HPAIV。實(shí)際生產(chǎn)中，蛋鴨和種鴨在幼齡時(shí)接種過疫苗，但成年鴨子常常沒有進(jìn)行足夠的加強(qiáng)免疫。以肉類消費(fèi)為目的水禽常常也不進(jìn)行免疫接種。因此，實(shí)際生產(chǎn)中免疫接種可能永遠(yuǎn)不會(huì)覆蓋所有的易感禽類，導(dǎo)致疫苗接種的效果大大降低。

3　小結(jié)

疫苗免疫接種在H5 HPAI的防控中發(fā)揮了重要作用。然而，由于免疫中存在實(shí)際困難，以及H5病毒快速的抗原漂移，致使家禽疫情仍有發(fā)生。臨床和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估結(jié)果表明，攻毒病毒、鴨的品種、免疫程序、疫苗是否正確使用、疫苗和流行毒之間的抗原同源性、疫苗中病毒抗原量、佐劑、是否加強(qiáng)免疫接種、免疫覆蓋率等因素，都可能影響到H5疫苗免疫接種的效果，甚至造成免疫失敗。

做好H5 HPAI的有效防控，除了開發(fā)有效的疫苗接種策略，如適合大規(guī)模疫苗接種的疫苗外，還應(yīng)建立有效的控制程序，包括免疫后監(jiān)測(cè)、嚴(yán)格的檢疫、動(dòng)物移動(dòng)控制、增加生物安全、消除被感染動(dòng)物和全面的公眾教育等一系列綜合措施。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Vaccines Against Duck H5 Subtype Highly Pathogenic Avian Inf uenza and Factors Inf uencing Its Eff ciency

Jiang Wenming，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Domestic ducks play an important role in the epidemiology of H5N1 highly pathogenic avian influenza （HPAI）viruses. Consequently，successful control over H5N1 HPAI in ducks is important for the eradication of the disease in poultry and for preventing infections in humans. Here we reviewed the current situation and progresses on duck H5N1 HPAIV vaccines and the factors that influence the efficiency of vaccines，including types of vaccines，duck species，vaccination schedules，homology between vaccine and challenge virus，adjuvants，and vaccination coverage.

duck；highly pathogenic avian influenza；H5；vaccination

S852.65

A

1005-944X（2015）12-0049-04

科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000），青島市科技計(jì)劃（14-2-4-105-jch）

陳繼明