黑龍江省一株馬流感病毒的全基因組測(cè)序及同源性分析

趙 釗，郭 巍，關(guān)平原，王曉鈞，呂 洋，安 茹

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001；3.北京市延慶縣農(nóng)業(yè)局，北京延慶 102100 ）

黑龍江省一株馬流感病毒的全基因組測(cè)序及同源性分析

趙 釗1，2，郭 巍2，關(guān)平原1，王曉鈞2，呂 洋3，安 茹3

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001；3.北京市延慶縣農(nóng)業(yè)局，北京延慶 102100 ）

通過采集一匹患病馬的病料及后續(xù)的病毒分離、病毒核酸提取、RT-PCR、連接T載體等一系列分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)病毒核酸進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)NCBI比對(duì)分析，獲得一株H3N8亞型馬流感病毒。將獲得的毒株與我國分離的A/equine/Jilin/1/1989禽源性毒株、2002年美國肯塔基分離株A/equine/Kentucky/1/02（美洲譜系Florida亞型）、A/equine/Argentine/77（美洲譜系A(chǔ)rgentine亞型）等有代表性毒株進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與Florida-2型馬流感病毒基因片段的同源率最高。根據(jù)馬流感病毒的命名規(guī)則，將這毒株命名為A/equine/Heilongjiang/1/2010。本次所分離到的黑龍江株馬流感病毒，豐富了我國馬流感病毒資源庫，為我國馬流感流行病學(xué)研究、診斷技術(shù)及疫苗研究提供了重要基礎(chǔ)。

馬流感病毒；基因組；同源性；分子生物學(xué)技術(shù)

馬流感（Equine infl uenza，EI）是由馬流感病毒（Equine infl uenza virus，EIV）所引起的一種急性傳染病。EIV是正粘病毒屬A型流感病毒，歷史上共出現(xiàn)過兩個(gè)亞型：H7N7和H3N8。然而近年鮮有H7N7亞型感染的報(bào)道［1］，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）認(rèn)為這種亞型毒株為不流行毒株，或者是呈亞臨床流行狀態(tài)。近年來，馬流感呈全球性流行的趨勢(shì)，全球僅新西蘭和冰島無馬流感疫情報(bào)告［2］，我國歷史上曾發(fā)生過四次大流行［3］。隨著賽馬業(yè)在我國的快速發(fā)展，馬流感防控更顯重要。一旦暴發(fā)馬流感，將會(huì)對(duì)馬養(yǎng)殖業(yè)、賽馬業(yè)等相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。

2010年，黑龍江省發(fā)現(xiàn)一例馬流感疑似病例。實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)患馬進(jìn)行了隔離，并采患馬的鼻咽拭子樣品進(jìn)行病毒分離與培養(yǎng)及全基因組的測(cè)序分析和同源性分析，確定了病毒來源。本次研究掌握了我國馬流感目前的流行毒株，對(duì)于馬流感的預(yù)防及后續(xù)疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑

感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自大連寶生物公司；EIV毒株A/equine/Jilin/1/1989由本實(shí)驗(yàn)室保存；本實(shí)驗(yàn)所使用SPF雞胚、SPF雞血由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

青霉素、鏈霉素購自Hyclone公司；病毒RNA 小量提取試劑盒購自Qiagen公司；DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Ex Taq PCR擴(kuò)增酶、pMD19-T Simple載體均購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2發(fā)病馬的臨床診斷及病料采集

通過對(duì)疑似馬流感患馬進(jìn)行臨床診斷后，將發(fā)病馬匹站立保定，用棉拭子經(jīng)前側(cè)鼻道伸入鼻咽部，沾取呼吸道粘液。在鼻咽部不同位置共采集樣品5個(gè)，保存于含40%甘油的磷酸鹽緩沖液中，每管約含4～5 mL緩沖液，4 ℃冰盒保存，迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.3病毒分離

在保存拭子的培養(yǎng)液中加入雙抗（青霉素1 000單位/mL，鏈霉素1 000 μg/mL），4℃作用2 h，充分?jǐn)D壓拭子后取保存液，置于離心機(jī)以2 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)尿囊腔接種于9 日齡SPF雞胚。每個(gè)樣品接種6 個(gè)雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育，廢棄接種后24 h內(nèi)死亡的雞胚。此后每12 h觀察1 次，取出死胚。經(jīng)72 h后，無菌收取所有24 h后死亡的雞胚尿囊液。利用上述方式繼續(xù)培養(yǎng)三代傳至第四代，將3個(gè)樣品的尿囊液經(jīng)HA 試驗(yàn)，選取HA效價(jià)最高的尿囊液保存于-80 ℃，取部分尿囊液進(jìn)行電鏡觀察。

1.4紅細(xì)胞凝集（HA）試驗(yàn)

采新鮮SPF雞血制備0.5 %雞紅細(xì)胞懸液，在V形底的96孔血凝板中每排的2到12 孔分別加入50 μL的PBS （pH7.2）。在每排的第一孔加入100 μL病毒尿囊液。在最后一排每孔加50 μL PBS，為紅細(xì)胞對(duì)照孔。做倍比稀釋：從第一孔轉(zhuǎn)移50 μL至下一孔，最后的50 μL棄去。然后加50 μL紅細(xì)胞懸液至每一孔，室溫孵育30 min，確定對(duì)照成立后，判讀結(jié)果。

1.5病毒RNA的提取

使用病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA。使用馬流感各片段通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。使用M-MLV做反轉(zhuǎn)錄，uni-12為特異性引物（5'ATCAAAAGCAGG），使用ExTaq做PCR（各基因片段PCR引物及擴(kuò)增條件見表1），所有擴(kuò)增都進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR完成后，將產(chǎn)物純化，插入pMD19-T Simple載體，送英俊生物工程有限公司測(cè)序。

表1　各基因片段PCR引物及PCR擴(kuò)增條件

1.6 同源性分析

使用DNAStar軟件，將本次分離病毒的HA、NA片段分別與1989 年吉林省分離株A/equine/ Jilin/1/1989（禽源毒株）、2002年美國肯塔基分離株A/equine/Kentucky/1/02（美洲譜系Florida亞型）、A/equine/Argentine/77（美洲譜系A(chǔ)rgentine亞型）的相對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行同源性分析。

2　結(jié)果

2.1臨床診斷

發(fā)病馬表現(xiàn)為精神不振、虛弱無力、頭下垂、食欲減少、結(jié)膜潮紅、流淚、體溫40℃，經(jīng)常干咳，鼻流黏性膿性分泌物，均為典型的流感癥狀。

2.2病毒分離培養(yǎng)及HA試驗(yàn)

將保存有鼻咽拭子的3個(gè)保存液預(yù)處理后，接種SPF雞胚，盲傳4代，經(jīng)HA試驗(yàn)，并設(shè)置陽性對(duì)照組。結(jié)果如圖1所示，陽性對(duì)照、陰性對(duì)照均正常，樣品結(jié)果可靠，且都有HA價(jià)，分別為24、25、26。

圖1　 HA試驗(yàn)結(jié)果

2.3電鏡觀察

選取效價(jià)為26的尿囊液分離物，用電子顯微鏡負(fù)染色觀察，發(fā)現(xiàn)典型的大小為100 nm左右的橢圓形流感病毒顆粒（圖2） 。

2.4病毒各基因片段擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

提取尿囊液中病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后測(cè)序（圖3），得到的8個(gè)基因片段的長度分別為：PB2（2280 bp）、PB1（2274 bp）、PA（2151 bp）、HA（1704 bp）、NP（1497 bp）、NA（1413 bp）、M（982 bp）、NS（838 bp）。各片段的基因信息已經(jīng)上傳NCBI，登記號(hào)為AGR45341～AGR45351。

圖2　 馬流感病毒電鏡負(fù)染圖

圖3　病毒各基因片段的RT-PCR擴(kuò)增

2.5同源性分析

將本次實(shí)驗(yàn)分離的病毒序列與各個(gè)流行株，包括禽源性（A/equine/Jilin/1/1989）及最近流行株Florida-2（A/equine/Kentucky/1/02）等進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本次分離發(fā)現(xiàn)的毒株與Florida-2型（A/ equine/Kentucky/1/02）同源率最高（表2）。根據(jù)流感病毒的命名規(guī)則，我們將此次發(fā)現(xiàn)的病毒命名為A/equine/Heilongjiang/1/2010。

表2　HA、NA 基因同源性分析

3 討論

通過對(duì)本次發(fā)病馬匹上分離到的病毒進(jìn)行全基因組測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)了一株Florida-2型的H3N8亞型EIV。通過將A/equine/Heilongjiang/1/2010病 毒的HA基 因 與Florida-2型（A/equine/Kentucky/1/02）的HA基因相比較，發(fā)現(xiàn)黑龍江株的ORF部分核苷酸發(fā)生了突變，但均為同義突變，并不會(huì)導(dǎo)致抗原性氨基酸的變異。

到目前為止，馬流感僅有H7N7和H3N8兩種亞型。早期的H7N7亞型于1956年由Sovi-nova等在布拉格分離得到，命名為A/馬/1/布拉格/1/56（我國原稱為馬甲1型），H3N8亞型于1963年由Waddell等在邁阿密分離得到，命名為A/馬/2/邁阿密/1/63（我國原稱為馬甲2型），是目前的流行株。H3N8亞型于二十世紀(jì)80年代分化為兩個(gè)譜系，根據(jù)其最初的地理位置分為美洲譜系和歐洲譜系［6］。美洲譜系中有三種亞型頻繁出現(xiàn)［7］，包括Florida亞型、Argentina亞型和Kentucky亞型，其中Florida亞型是目前我國的主要流行株，其自身也分為兩種不同的抗原類型：1型與2型。

對(duì)于馬流感的預(yù)防，目前國際上主要采用接種疫苗的手段。目前使用的包括正在研制的疫苗主要是全價(jià)滅活疫苗、亞單位疫苗、弱毒疫苗和DNA疫苗。滅活苗由于其抗原成分齊全，免疫原性強(qiáng)，且安全性好，不會(huì)有毒力返強(qiáng)和變異的危險(xiǎn)，一直很受歡迎；目前的亞單位疫苗主要是利用分子生物學(xué)手段，表達(dá)EIV的HA和NA蛋白，使機(jī)體產(chǎn)生抗體，經(jīng)亞單位疫苗免疫接種的馬，可產(chǎn)生特異性的IgGa和IgGb，比全毒滅活疫苗效果更好［8］；減毒活疫苗由于保留了病毒原有的部分活性，可通過自然途徑感染機(jī)體并在體內(nèi)復(fù)制，可激發(fā)長期而有效的免疫應(yīng)答［9］；接種DNA疫苗后，馬機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)生特異性的IgGa、IgGb和IgA，同時(shí)特異性淋巴細(xì)胞增生、γ-IFN的合成增加［10-12］。由于我國目前還無馬流感疫苗，本實(shí)驗(yàn)室正在研制，因此必須要了解國內(nèi)馬流感目前的流行株，從而使疫苗具有更好的針對(duì)性。此次黑龍江株病毒的發(fā)現(xiàn)，說明國內(nèi)已經(jīng)傳入Florida-2型病毒，也提醒我國要預(yù)防此種毒株在國內(nèi)的大規(guī)模流行，并且對(duì)疫苗的研制有一定的指向作用。

［1］ Webster R. Are equine I influenza viruses still present in horse［J］. Equine Vet，1993，25 （6）：537-538.

［2］ OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals［M］. Paris：OIE，2012.

［3］ 楊建德，相文華，薛飛，等. 我國馬流感的研究現(xiàn)狀［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002（3）：3.

［3］ Lewis N S，Daly J M. Antigenic and Genetic Evolution of Equine Influenza A （H3N8） Virus from 1968 to 2007 ［J］. Journal of Virology，2011（23）：12742-12749.

［5］ Zhu C，Li Q，Guo W，et al. Complete Genomic Sequences of an H3N8 Equine Influenza Virus Strain Isolated in China ［J］. Genome Announcements，2013（4）：1.

［6］ Daly J M，Lai A C，Binns M M. Antigenic and genetic evolution of equine H3N8 influenza A viruses ［J］. J Gen Virol，1996，77（4）：661-671.

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［8］ Daly J M，Newton J R. Current perspectives on control of equine influenza ［J］. Vet Res，2004，35（4）：411-423.

［9］ Quinlivan M，Zamarin D，Garcia-Sastre A. Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein［J］. J Virol，2005，79（13）：8431-8439.

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（責(zé)任編輯：胡藕祥）

Whole Genome Sequencing and Homology Analysis of An Equine Inf uenza Virus Strain in Heilongjiang Province

Zhao Zhao1，2，Guo Wei2，Guan Pingyuan1，Wang Xiaojun2，L? Yang3，An Ru3
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia 010018；2. Harbin Veterinary Research Institute，CAAS，Harbin，Heilongjiang 150001；3.Yanqing Agricultural Bureau of Beijing，Yanqing，Beijing 102100）

Through the collection of pathological specimen from a diseased horse and subsequent virus isolation，virus nucleic acid extraction，RT-PCR and a series of molecular biology techniques，ultimately the virus nucleic acid was sequenced. The H3N8 subtype of equine influenza virus was obtained by sequencing and NCBI comparison analysis. The strain was compared with A/equine/Jilin/1/1989，A/equine/Kentucky/1/02（Florida subtype）and A/equine/Argentine/77（Argentine subtype），and the highest homology was found between the strain and the Florida-2subtype.According to the nomenclature of the equine influenza virus，the virus was named A/equine/Heilongjiang/1/2010. The Heilongjiang strain of equine influenza virus isolated from this research enriched the resource base of the influenza virus in China. It also provided an important basis for the study of equine influenza epidemiology in the country.

equine influenza virus；genome；homology；molecular biology technique

S852.65+2

A

1005-944X（2015）12-0069-04

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD46B03）

關(guān)平原