牛結(jié)核分枝桿菌株快速培養(yǎng)方法的對比

古努爾·吐爾遜，努爾拜合提，沙依蘭·卡依扎，王俊偉，呼西旦·阿巴拜克力

（新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

牛結(jié)核分枝桿菌株快速培養(yǎng)方法的對比

古努爾·吐爾遜，努爾拜合提，沙依蘭·卡依扎，王俊偉，呼西旦·阿巴拜克力

（新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

［目的］應用引進的Va間接培養(yǎng)方法、傳統(tǒng)的丙酮酸鈉、L-J培養(yǎng)基直接培養(yǎng)方法對牛結(jié)核分枝桿菌生長時間進行對比試驗。［方法］將牛型結(jié)核分枝桿菌接種于含0.1%瓊脂Va培養(yǎng)基中預培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接到含0.3%瓊脂Va培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d后分別轉(zhuǎn)接到丙酮酸鈉培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基上（間接法）；同時牛型結(jié)核分枝桿菌接菌于丙酮酸鈉培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育（直接方法），每天觀察，并記錄出現(xiàn)菌落時間。［結(jié)果］接種Va培養(yǎng)基的菌株分別轉(zhuǎn)接丙酮酸鈉培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基后第3 d可見菌落，第12 d培養(yǎng)基斜面可見典型的牛型結(jié)核分枝桿菌菌落；而直接接種于丙酮酸鈉培養(yǎng)基與L-J培養(yǎng)基后分別于第26 d和第31 d可見典型的牛型結(jié)核分枝桿菌菌落。［結(jié)論］引進的Va牛型結(jié)核分枝桿菌間接培養(yǎng)方法可以縮短菌落培養(yǎng)時間，為牛型結(jié)核桿菌病提供早期診斷依據(jù)。

丙酮酸鈉培養(yǎng)基；L-J培養(yǎng)基；牛結(jié)核分枝桿菌株；Va培養(yǎng)基；早期診斷

牛結(jié)核病是主要由牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患慢性消耗性傳染病。牛結(jié)核分枝桿菌是一種抗酸的桿菌，是結(jié)核分枝桿菌復合群，主要通過吸入傳播。牛結(jié)核病的有效控制手段是及時和有效的診斷［1-2］。結(jié)核病細菌學的方法是實驗室診斷的主要方法之一。常用的培養(yǎng)基有改良羅氏培養(yǎng)基（L-J培養(yǎng)基）和丙酮酸鈉培養(yǎng)基［3-4］，雖然這兩種培養(yǎng)基已有百年的歷史［5］，但是這兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間長，需4～8周，達不到快速診斷的目的［6-8］。為了使牛結(jié)核分枝桿菌能快速培養(yǎng)，本實驗引進了快速培養(yǎng)方法，即將牛結(jié)核分枝桿菌在Va培養(yǎng)基中先進行預培養(yǎng)后再用L-J培養(yǎng)基和丙酮酸鈉培養(yǎng)基進行培養(yǎng)（間接法），并與直接培養(yǎng)在兩種培養(yǎng)基（直接法）進行比較，初步證實了間接法能縮短培養(yǎng)時間?，F(xiàn)報告如下：

1　材料

1.1實驗材料

牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株購于中國藥品生物制品檢定所菌苗室，本室保存。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1Va培養(yǎng)基配方引進于哈薩克斯坦哈薩克科學獸醫(yī)研究所結(jié)核病研究室，在本實驗室制備。含0.1%瓊脂Va培養(yǎng)基主要成份：KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4，二水檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O），檸檬酸鐵銨，L-天冬酰胺，甘油，瓊脂粉；含0.3%瓊脂Va培養(yǎng)基主要成份：除含200%糖外，其他成份同含0.1%瓊Va培養(yǎng)基。

1.2.2自制丙酮酸鈉培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基。

2　方法

2.1直接法培養(yǎng)

牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株在無菌環(huán)境下加生理鹽水研磨稀釋，分別接種于丙酮酸鈉培養(yǎng)基、L-J培養(yǎng)基的斜面上0.2 ml菌液，每天觀察細菌生成情況并記錄。

2.2間接法培養(yǎng)

取無菌處理的牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株0.2 ml加入到含0.1%瓊脂的Va培養(yǎng)基內(nèi)，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻后，置37 ℃培養(yǎng)箱預孵育24 h后，再用無菌的玻璃吸管吸取0.2 ml的含培養(yǎng)基的菌液垂直穿刺到含0.3%瓊脂的Va培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育6 d，再用吸管吸取穿刺培養(yǎng)的菌液到丙酮酸鈉培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基斜面上，置37 ℃培養(yǎng)箱培育，每天觀察并記錄。

3　結(jié)果

3.1直接法培養(yǎng)

牛型結(jié)核分枝桿菌標準菌株直接在丙酮酸鈉和L-J培養(yǎng)基上均生長良好。培養(yǎng)后，在丙酮酸鈉培養(yǎng)基上培養(yǎng)13 d可看到菌落長出，26 d 后長出典型的菌落；在L-J培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d可看到菌落長出，31 d后長出典型的菌落（表1）。

3.2間接培養(yǎng)方法

牛型結(jié)核分枝桿菌標準菌株接種于Va培養(yǎng)基預培養(yǎng)后，分別轉(zhuǎn)接丙酮酸鈉培養(yǎng)基和L-J培養(yǎng)基每天觀察一次菌落生長及污染情況。接種后2 d在兩種培養(yǎng)基上可以看到似有菌生長的跡象，3 d可看到菌落長出，預培養(yǎng)全過程需 10 d；12 d均已長出典型的菌落（表1、圖1），預培養(yǎng)全過程需19 d。未出現(xiàn)培養(yǎng)污染。

表1　牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株直接法和間接法培養(yǎng)結(jié)果比較

圖1　牛結(jié)核分枝桿菌標準菌株用間接法培養(yǎng)

4　討論

結(jié)核病的細菌學檢測是結(jié)核病控制、流行病學調(diào)查以及臨床診斷與鑒別診斷的“金標準”［9］，也是最直接的方法。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)在結(jié)核病細菌學診斷方面具有決定性意義，而且提高陽性率［10］，因此細菌培養(yǎng)在某種程度上利于提高結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)率。該方法是結(jié)核病確證最可靠的方法，也是獲得純培養(yǎng)物進行菌種鑒定、藥物敏感性試驗，以及分子流行病學分析等其它生物學研究的基礎［11］。但是牛結(jié)核分枝桿菌在傳統(tǒng)的L-J培養(yǎng)基和丙酮酸鈉培養(yǎng)基生長比較緩慢，營養(yǎng)要求高。本研究用傳統(tǒng)的L-J培養(yǎng)基和丙酮酸鈉培養(yǎng)基與引進的Va間接培養(yǎng)基進行比較培養(yǎng)可見，間接培養(yǎng)方法先預培養(yǎng)再轉(zhuǎn)接L-J培養(yǎng)基和丙酮酸鈉培養(yǎng)基第3 d出現(xiàn)可見菌落，預培養(yǎng)全過程需10 d，第12 d培養(yǎng)基斜面出現(xiàn)典型菌落，預培養(yǎng)全過程需19 d。而在直接接種丙酮酸鈉培養(yǎng)基形成菌落所需要的天數(shù)是26 d；在L-J培養(yǎng)基形成菌落所需要的天數(shù)是31 d（會不會出現(xiàn)假陽性）。結(jié)果說明，在Va培養(yǎng)基進行預培養(yǎng)后，可能提高細菌增殖率，降低在生長過程中高營養(yǎng)的需求，從而加速了牛型結(jié)核分枝桿菌的生長，縮短了培養(yǎng)時間。該Va培養(yǎng)基具有陽性菌培養(yǎng)時間較短、生長速度較快且形成典型菌落等特點，培養(yǎng)成本低。牛結(jié)核桿菌培養(yǎng)前在Va培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)能夠縮短培養(yǎng)基時間，對結(jié)核病的科研研究和早期診斷有一定的意義。

［1］潘美玉，吳龍章，陳劍鋒，等. 兩種不同固體培養(yǎng)基對結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率的影響［J］.實用醫(yī)學雜志，2012，28（5）：830-831.

［2］溫貴華，劉晉洪，劉婷，等. 結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)基臨床應用研究［J］. 國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（5）：526-527.

［3］Nazym S S，Kairat A T，Bolat A Y，et al. The Medium for Acceleration of Mycobacterium tuberculosis growth［J］ . Health， 2014（6）：1866-1873.

［4］古努爾·吐爾遜，努爾巴哈提，古麗拜克熱木.斯拉吾丁，等.屠宰場疑似牛結(jié)核病料的細菌分離和PCR鑒定［J］. 草食家畜，2015（3）：39-42.

［5］Lawson L，Emenyonu N，Saddiq T A，et al. Comparison of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility using solid and liquid culture in Nigeria［J］ . BMC Research Notes，2013（6）：215-219.

［6］Chien H P，Yu M C，Wu M H，et al. Comparison of the BACTEC-MGIT-960 with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2000，4（9）：866-870.

［7］Chihota V N，Grant A D，F(xiàn)ielding K，et al. Liquid vs. solid culture for tuberculosis：performance and cost in a resourceconstrained setting［J］. Int J Tuberc Lung Dis 2010，14（8）：1024-1031.

［8］Srisuwanvilai L O，Monkongdee P，Podewils L，et al. Performance of the BACTEC-MGIT-960 compared with solid media for detection of Mycobacterium in Bangkok Thailand［J］. Diagn Microbiol Infect Dis，2008，61（4）：402-407.

［9］張思潮，邱志紅，陸惠勤. 不同痰液標本肺結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)果比較［J］. 浙江預防醫(yī)學，2008，20（1）：95

［10］劉志輝，羅魯. 結(jié)核病實驗室診斷現(xiàn)狀及展望［J］. 中國防癆雜志，2003，25（3）：38-40.

［11］咸愛金. 結(jié)核分枝桿菌在兩種培養(yǎng)基上生長情況的觀察比較［J］.航空航天醫(yī)學雜志. 2013，24（2）：188-189.

（責任編輯：朱迪國）

Comparison of Rapid Culture Methods of Mycobacterium Bovis

Gulnur·Tursun，Nuerbaiheti，Shayilan·Kayizha，Wang Junwei，Huxidan·Ababaikeli
（Veterinary Research Institute of Animal Science Academy of Xinjiang，Urumqi，Xinjiang 830000）

［Objective］ To apply the introduction of Va medium composition indirect method and the traditional culture medium of sodium pyruvate，L-J medium cultivation method by direct methods，to compare the bovine mycobacterium tuberculosis growth time. ［Method］The standard strains，which were processed with pre-culture in 0.1% agar Va media during 24 h and incubated in 0.3% agar Va media for 6 days at 37℃，were transferred into sodium pyruvate medium and L-J medium respectively. Meanwhile the standard strains were directly inoculated into sodium pyruvate medium and L-J medium. And then via the incubation at 37，it was observed that the examination was done daily until growth of colonies. ［Result］Growth of mycobacteria cultures of Mycobacterium bovis in sodium pyruvate medium and L-J medium was observed on the 3th day by the indirect method，and growth of the typical colonies were observed on the 12th day in the two mediums. However，growth of the colonies of mycobacteria in the sodium pyruvate medium and the L-J medium did on the 26th day and the 31th day through direct methods respectively. ［Conclusion］Introduction of the indirect method can shorten the growth time of the colonies，and provide early diagnosis basis for Mycobacterium bovis.

sodium pyruvate media；L-J media；Mycobacterium bovis；Va culture media；early diagnosis

S851.3

B

1005-944X（2015）12-0056-03

新疆維吾爾自治區(qū)國際科技合作計劃項目（20136005）

呼西旦.阿巴拜克力