優(yōu)化“分離以尿素為氮源的微生物”的實(shí)驗(yàn)

劉怡+吳彬

“分離以尿素為氮源的微生物”的實(shí)驗(yàn)屬于高中生物學(xué)選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》（浙科版）中的內(nèi)容。該模塊是為了滿足學(xué)生多樣化發(fā)展的需要而設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)課，但在實(shí)際教學(xué)中，由于受到高考要求和實(shí)驗(yàn)條件的限制，真正以實(shí)驗(yàn)形式開(kāi)展教學(xué)的學(xué)校很少，對(duì)于該實(shí)驗(yàn)的理解也停留在了理論的層面上，缺乏實(shí)際的操作實(shí)踐。本文在實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合教學(xué)實(shí)踐的嘗試，針對(duì)該實(shí)驗(yàn)中存在的一些問(wèn)題進(jìn)行了反思，提出了一些改進(jìn)的策略。

一、實(shí)驗(yàn)材料的選擇和處理

該實(shí)驗(yàn)的目的是使用含有尿素的培養(yǎng)基分離有脲酶的細(xì)菌和利用指示劑顏色的變化檢知脲酶所催化的反應(yīng);實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容是從土壤中分離出能利用尿素的細(xì)菌，觀察菌落數(shù)，了解它在生態(tài)平衡中的作用，并以LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基為對(duì)照，觀察全營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)。為了獲得實(shí)驗(yàn)的成功，首先必須正確地選擇和處理實(shí)驗(yàn)材料。[1]

（一）土樣的獲取

為了分離到能分解尿素的細(xì)菌，需要獲取合適的土樣。教材中只提到從有哺乳動(dòng)物排泄物的地方獲取，具體的方法并未說(shuō)明，操作過(guò)程中由于實(shí)驗(yàn)材料獲取不當(dāng)很容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。土壤中的微生物數(shù)量繁多、種類復(fù)雜，在富含有機(jī)質(zhì)的土壤表層，有更多微生物生長(zhǎng)。細(xì)菌適宜在中性環(huán)境的潮濕土壤中生長(zhǎng)，且絕大多數(shù)分布在距地表約3～8cm的土壤層。因此在土壤取樣時(shí)，可以從施用人畜糞便的農(nóng)田等環(huán)境中選擇肥沃、濕潤(rùn)的土壤，先鏟去表層土3cm左右再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中備用。

（二）制備土壤稀釋液

教材中只說(shuō)明了制備土壤稀釋液的過(guò)程要在無(wú)菌條件下進(jìn)行，實(shí)際上土樣的稱取也應(yīng)該無(wú)菌操作，在超凈臺(tái)上酒精燈火焰旁進(jìn)行。

在無(wú)菌條件下，稱取1g土樣，加到99mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩，即成10-2稀釋液，從該稀釋液中取0.5mL懸液加到4.5mL無(wú)菌水的試管中，經(jīng)振蕩制成10-3 稀釋液，再依次制備10-4、10-5土壤稀釋液。實(shí)驗(yàn)要求每次稀釋后都要振蕩10min，在實(shí)際教學(xué)中很難有那么長(zhǎng)的時(shí)間給學(xué)生操作，可以適當(dāng)縮短振蕩時(shí)間，混勻即可。

二、尿素固體培養(yǎng)基的配制

該實(shí)驗(yàn)中分離以尿素為氮源的微生物所依據(jù)的原理是在氮源只有尿素時(shí)，這些微生物能利用尿素獲得氮源而存活，其他微生物則因?yàn)槿狈Φ炊劳?，因此尿素固體培養(yǎng)基的配制是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

（一）用瓊脂糖代替瓊脂

其他版本的教材中配制尿素固體培養(yǎng)基時(shí)添加的是瓊脂，浙科版教材改為瓊脂糖。瓊脂在制作固體培養(yǎng)基時(shí)可作為凝固劑，但它是一種未被純化的混合物，里面有一定量的含氮化合物。

瓊脂糖是瓊脂進(jìn)一步純化，去除了含氮化合物后的產(chǎn)物。利用瓊脂糖作凝固劑，能防止含氮化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，有利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選。

（二）適當(dāng)降低尿素的濃度

教材中配制尿素培養(yǎng)基時(shí)，25mL培養(yǎng)基溶液中是加入了10mL含有2g尿素的尿素溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了8%，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)這種培養(yǎng)基培養(yǎng)長(zhǎng)出的細(xì)菌含量很少，10-2的稀釋度下也只是偶爾能看到1個(gè)菌落，高的稀釋度下更難有結(jié)果出現(xiàn)。文獻(xiàn)資料表明，尿素可在脲酶的作用下水解成碳酸銨進(jìn)而生成氨，尿素濃度過(guò)高，產(chǎn)生的氨太多會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH增大，不利于細(xì)菌生長(zhǎng)。[2]若尿素濃度過(guò)低，產(chǎn)生的氨太少，酚紅的顯色現(xiàn)象則不明顯。

為了確定尿素溶液的最佳比例，筆者配制了不同濃度梯度的尿素溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在25mL培養(yǎng)基溶液中分別加入10mL含有0.25g、0.5g、1g、1.5g、2g尿素的尿素溶液，結(jié)果表明，添加0.5g尿素的培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)較多，顯色現(xiàn)象較明顯。由此可見(jiàn)，適當(dāng)降低配方中的尿素濃度，有利于實(shí)驗(yàn)效果的改善。

（三）尿素溶液的滅菌方法

尿素加熱后會(huì)分解，因此不能使用高壓蒸汽滅菌，一般采用的是過(guò)濾除菌法，可以使用G6玻璃漏斗或針頭式過(guò)濾器過(guò)濾。教材中采用的是G6玻璃漏斗過(guò)濾的方法。玻璃漏斗使用前要先在121℃下用紙包好滅菌，使用后需要用1mol/L的HCl浸泡，并抽濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存，操作起來(lái)非常煩瑣，且過(guò)濾耗時(shí)很長(zhǎng)。目前實(shí)驗(yàn)室中廣泛采用的過(guò)濾處理裝置為針頭式過(guò)濾器。一次性針頭式過(guò)濾器可與一次性注射器配套使用，過(guò)濾尿素時(shí)，一般選擇孔徑為0.22μm的針頭式過(guò)濾器。這種方法不需要換膜和清洗濾器，省去了復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的準(zhǔn)備工作，使用起來(lái)快速方便。

也可以使用化學(xué)滅菌法對(duì)尿素滅菌。取麝香草酚結(jié)晶一塊，在燒杯中用蒸餾水反復(fù)洗滌三次，然后置于一定量的尿素溶液中，在冰箱內(nèi)保存24小時(shí)后即可使用。由于麝香草酚對(duì)霉菌的抑制力較差，故配好后應(yīng)在冰箱中保存，以免受到霉菌污染而使尿素失效，同時(shí)可以長(zhǎng)期使用。這種方法非常簡(jiǎn)便，效果也較好，在醫(yī)院中經(jīng)常使用。

三、稀釋涂布分離法的操作

分離以尿素為氮源的微生物需要使用稀釋涂布分離的方法，教材中只是簡(jiǎn)要介紹了稀釋涂布的內(nèi)容和程序，對(duì)于移液槍的正確使用和涂布法的操作都沒(méi)有說(shuō)明，對(duì)于首次使用涂布分離法的學(xué)生來(lái)說(shuō)困難很大。

（一）移液槍的使用方法

在設(shè)定容量時(shí)先通過(guò)粗調(diào)將容量值迅速調(diào)整至接近自己的預(yù)想值，再將移液槍橫置，水平放置在自己的眼前進(jìn)行細(xì)調(diào)，慢慢將容量值調(diào)至預(yù)想值，從而避免視覺(jué)誤差。需要特別注意的是，從大值調(diào)整到小值時(shí)，剛好就行;但從小值調(diào)整到大值時(shí)，需要調(diào)超1/3圈后再返回，這是因?yàn)橛?jì)數(shù)器里面有一定的空隙需要彌補(bǔ)。在該過(guò)程中，不能將按鈕旋出量程，否則會(huì)卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了移液槍。將移液槍垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)即可使其緊密結(jié)合。

在吸取液體之前，應(yīng)該先預(yù)吸取、排放三次，讓吸頭內(nèi)壁吸附一層液膜，確保移液的精度和準(zhǔn)度。吸液時(shí)，先將移液槍排放按鈕按至第一停點(diǎn)，再將吸頭垂直浸入液面2～4mm以下，然后慢慢松開(kāi)按鈕回原點(diǎn)。放液時(shí)，先將按鈕按至第一停點(diǎn)排出液體，稍停片刻后，繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)吹出殘余的液體，最后松開(kāi)按鈕，確保吸頭內(nèi)無(wú)殘留液體。整個(gè)過(guò)程應(yīng)保持慢吸慢放，避免速度太快而產(chǎn)生反沖和氣泡，導(dǎo)致移液的體積不準(zhǔn)確，同時(shí)還要注意是否會(huì)有漏氣現(xiàn)象。endprint

（二）涂布分離的操作

涂布分離時(shí)，若平板不干燥，會(huì)影響涂布的效果，有時(shí)會(huì)因涂布不均勻使某些部位的菌落不能分開(kāi)，或在培養(yǎng)基上出現(xiàn)一層薄膜。因此涂布前可將制備好的平板預(yù)先放在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)一段時(shí)間，待表面水分蒸發(fā)后再進(jìn)行涂布。取0.1mL 10-4、10-5土壤稀釋液加入尿素培養(yǎng)基和全營(yíng)養(yǎng)LB培養(yǎng)基中，右手持玻璃刮刀平放在培養(yǎng)基表面，將菌液沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，可以先按一條線輕輕地來(lái)回推動(dòng)，使菌液分布均勻，然后再按其垂直方向來(lái)回推動(dòng)，平板邊緣可弧線推動(dòng)。需要注意的是，涂布完成后不宜立即將培養(yǎng)基倒置，而應(yīng)先在室溫下靜置5～l0min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，再將培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)。

此外，玻璃刮刀在使用前保存在70%酒精中，使用時(shí)先將玻璃刮刀在酒精燈火焰上引燃，待酒精燃盡、火焰熄滅后，先在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)稍作冷卻后再進(jìn)行涂布。切忌將剛剛灼燒過(guò)的玻璃刮刀立即放入酒精中，以免高溫引起酒精燃燒，造成危險(xiǎn)。更換稀釋度時(shí)，需要將玻璃刮刀灼燒滅菌并更換玻璃刮刀，若由低濃度向高濃度更換，也可以不更換。因此，建議先進(jìn)行10-5土壤稀釋液的涂布，再進(jìn)行10-4土壤稀釋液的涂布，這樣在使用移液槍滴加液體時(shí)可以不用換槍頭，玻璃刮刀也可以不用更換，省去了許多麻煩。

四、培養(yǎng)時(shí)間的調(diào)整

該實(shí)驗(yàn)中利用酚紅作為指示劑檢測(cè)脲酶所催化的反應(yīng)，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為24～48h。

酚紅是一種酸堿指示劑，顯色范圍為pH6.4～8.2，酸性條件下顯黃色，堿性條件下顯紅色。細(xì)菌培養(yǎng)后，產(chǎn)生的脲酶將尿素分解成氨，從而使酚紅由黃變紅，從而可以檢測(cè)出細(xì)菌是否已將尿素分解。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，紅色區(qū)域的面積越來(lái)越大，據(jù)此也可以判斷細(xì)菌分解尿素能力的強(qiáng)弱。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在含有酚紅的培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)較緩慢。在沒(méi)有添加酚紅的尿素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后即可看到明顯的菌落產(chǎn)生;添加了酚紅的培養(yǎng)基中，則要到48h后才能看到菌落出現(xiàn)，若要觀察到顯色反應(yīng)，時(shí)間則更久，至少需要72h，甚至一周左右。因此，建議可以將培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)至72h以后，紅色也會(huì)越來(lái)越明顯。

五、改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)效果

根據(jù)預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有脲酶的細(xì)菌菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)著色環(huán)帶，但教材中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片只能顯示出兩種培養(yǎng)基上細(xì)菌數(shù)量的不同，并沒(méi)有清楚地看見(jiàn)紅色環(huán)帶，學(xué)生很難產(chǎn)生直觀的認(rèn)識(shí)。經(jīng)過(guò)反思和改進(jìn)后，取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果，如圖1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同的稀釋度下，全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中有較多菌落，尿素培養(yǎng)基中只有少量菌落;全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中菌落種類多樣，尿素培養(yǎng)基中菌落種類較單一;有脲酶的細(xì)菌菌落周圍出現(xiàn)紅色環(huán)帶，菌落較多的尿素培養(yǎng)基逐漸變紅。值得注意的是，理論上尿素培養(yǎng)基中分離出的只有以尿素為氮源的細(xì)菌，但實(shí)際上尿素培養(yǎng)基中分離出的細(xì)菌不一定全都是以尿素為氮源的，有些細(xì)菌會(huì)利用其他微生物代謝的產(chǎn)物為氮源，如尿素分解后產(chǎn)生的氨就可為硝化細(xì)菌提供氮源，[3]因此還需要通過(guò)進(jìn)一步的檢測(cè)確定細(xì)菌的種類。

六、小結(jié)與反思

“分離以尿素為氮源的微生物”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)不僅有助于學(xué)生更深入地認(rèn)識(shí)微生物的利用，拓展生物科技視野，增進(jìn)對(duì)生物科技與社會(huì)關(guān)系的理解，還有助于提高設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)手操作等科學(xué)探究的能力。充分的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和良好的實(shí)驗(yàn)效果是提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)有效性、達(dá)成教學(xué)目標(biāo)的基本途徑和重要手段。

經(jīng)過(guò)改良后的實(shí)驗(yàn)方案，既提高了實(shí)驗(yàn)的效率，又能取得較好的實(shí)驗(yàn)效果，學(xué)生們基本都能培養(yǎng)分離得到以尿素為氮源的細(xì)菌并觀察到紅色環(huán)帶的現(xiàn)象。成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和動(dòng)力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的自信心和積極性，提升對(duì)生物學(xué)科的熱愛(ài)，有助于知識(shí)的意義建構(gòu)，大大提高了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的有效性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李其安.高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的問(wèn)題及解決策略[J].中學(xué)生物學(xué)，2012（9）：13-14.

[2] 竇向梅，王愛(ài)麗，郭寧寧.“分離以尿素為氮源的微生物”的實(shí)驗(yàn)改進(jìn)[J].生物學(xué)通報(bào)，2010（11）：51-53.

[3] 畢詩(shī)秀.“分離以尿素為氮源的微生物”實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)及組織[J].生物學(xué)通報(bào)，2013（3）：32-36.endprint