不同來(lái)源脂肪酶抗逆性的對(duì)比研究

■米 雁 朱琳娜 蔡青和 陳國(guó)營(yíng) 程媛媛

(上海歐耐施生物技術(shù)有限公司，上海201606)

脂類是能量含量最高的營(yíng)養(yǎng)素，20世紀(jì)50年代，國(guó)內(nèi)外已將脂類物質(zhì)用于家禽飼料中，但是隨著動(dòng)物日糧中脂類物質(zhì)添加量的增加，飼料顆粒變軟，質(zhì)量下降，粗脂肪利用率下降。脂肪酶屬于消化酶，又稱三酰甘油?；饷?，不僅催化酯水解還可以催化合成酯和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。幼齡畜禽內(nèi)源脂肪酶分泌不足是制約其利用飼糧中脂肪的主要原因，添加外源脂肪酶可以將外源脂肪消化分解為游離脂肪酸、甘油和甘油單酯后才能被動(dòng)物所利用，提高飼糧中脂肪能量的利用率。

研究表明，斷奶仔豬日糧中添加脂肪酶在一定程度上可改善生產(chǎn)性能，提高飼料報(bào)酬[1-3]，生長(zhǎng)肥育豬飼糧中添加脂肪酶在提高干物質(zhì)和能量的真消化率，在提高有機(jī)物、粗蛋白、灰分的表觀消化率方面也有一定的效果[4-5]。添加不同全脂米糠的肉雞日糧中添加脂肪酶能提高11～14 d肉仔雞的生長(zhǎng)性能和全脂米糠的表觀代謝能[6]，但不同來(lái)源的脂肪酶效果差異也很大。

在實(shí)際應(yīng)用中，由于受飼料制粒過(guò)程中高溫、高濕和擠壓的影響，且動(dòng)物消化道環(huán)境的pH值在不同部位差異很大，這對(duì)脂肪酶的耐穩(wěn)定性和耐酸堿性提出了要求和挑戰(zhàn)。為此，本研究選用實(shí)際生產(chǎn)中不同來(lái)源的脂肪酶產(chǎn)品，對(duì)其在不同溫度和pH值處理下酶活變化的情況進(jìn)行了對(duì)比評(píng)定，為脂肪酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供試驗(yàn)指導(dǎo)，也為飼料企業(yè)選擇合適的脂肪酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器及試劑

精密pH計(jì)（0.01）、恒溫水浴箱、磁懸振蕩器、高速勻漿機(jī)、電子天平、電冰箱、秒表、堿式滴定管；試劑若無(wú)特殊說(shuō)明，均為分析純，所用溶劑和水無(wú)注明時(shí)均為蒸餾水。

1.1.2 試驗(yàn)用酶

三種不同來(lái)源的脂肪酶樣品由上海歐耐施生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供，分別標(biāo)示為脂肪酶A、B、C，其酶活分別為10 000、10 000、100 000 U/g（按照以下測(cè)定方法的實(shí)測(cè)值為準(zhǔn)）。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酶活力的測(cè)定

① 酶活定義：1 g固體酶粉（或1 ml液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為一個(gè)酶活力單位，以U/g（U/ml）表示。

② 底物配置：稱取聚乙烯醇（PVA）40 g（精確至0.1 g），加水800 ml，在沸水浴中加熱，攪拌，直至全部溶解，冷卻后定容至1 000 ml，用干凈的雙層紗布過(guò)濾，取濾液備用；量取上述濾液150 ml，加橄欖油50 ml，用高速勻漿機(jī)處理6 min（分6次處理，間隔1 min，每次處理1 min），即得乳白色PVA乳化油，該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

③pH值7.5的磷酸緩沖液：分別稱取磷酸二氫鉀1.96 g和十二水磷酸氫二鈉39.62 g，用水溶解并定容至500 ml。

④0.05 mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)GB/T 601配制與標(biāo)定。使用時(shí)，準(zhǔn)確稀釋10倍。

⑤酶活的測(cè)定：取兩個(gè)100 ml三角瓶，分別于空白瓶A和樣品瓶B中各加入底物溶液4 ml和磷酸緩沖液5 ml，再于A瓶中加入95%乙醇15 ml，于40℃水浴中預(yù)熱5 min，然后于A、B瓶中各加待測(cè)酶液1 ml，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15 min后，于B瓶中補(bǔ)加95%乙醇15 ml，終止反應(yīng)，取出。再于A、B瓶中各加酚酞指示劑兩滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30 s不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

X—樣品的酶活力（U/g）；

V1—滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；

V2—滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ml）；

c—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/l）；

50—0.05 mol/l氫氧化鈉溶液1 ml相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；

n1—樣品的稀釋倍數(shù)；

0.05—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液換算系數(shù)；

1/15—反應(yīng)時(shí)間15 min，以1 min計(jì)。

1.2.2 不同條件處理對(duì)脂肪酶酶活的影響

1.2.2.1 溫度對(duì)脂肪酶酶活的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g脂肪酶樣品，用酶保護(hù)液（5 ml甘油/100 ml，pH值7.5磷酸緩沖液）定容到100 ml，磁力常溫?cái)嚢?0 min，離心取上清液待用。

將盛有9 ml保護(hù)液的試管分別置于40、50、60℃和80℃的水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后分別加入1 ml酶上清液迅速搖勻并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5 min，迅速取出于冰水浴中冷卻，冷卻后進(jìn)一步稀釋酶活。然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定脂肪酶酶活，注意對(duì)不同溫度處理的酶樣分別設(shè)置空白對(duì)照組。

1.2.2.2 pH值對(duì)脂肪酶酶活的影響

配制0.1 mol/l的檸檬酸溶液，0.5 mol/l的氫氧化鈉溶液備用。

配制A：0.05 mol/l的檸檬酸溶液，B：0.1 mol/l的磷酸氫二鈉溶液，將A、B兩種溶液按照一定比例融合，并用A或者B溶液調(diào)整pH值至3.0、4.0、5.0和6.0的緩沖液。

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g酶樣品，溶于50 ml的蒸餾水中，磁力常溫?cái)嚢?0 min，靜置一段時(shí)間，分別量取9 ml不同pH值的緩沖液，于37℃水域中預(yù)熱10 min，然后加入1 ml酶上清液搖勻，繼續(xù)在37℃水浴中靜置2 h，迅速取出，用pH值7.5的緩沖液繼續(xù)稀釋，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定脂肪酶酶活，對(duì)不同pH值處理的酶樣分別設(shè)置空白對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度處理對(duì)脂肪酶酶活的影響

不同溫度對(duì)脂肪酶酶活的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，脂肪酶A、B、C三者的最適溫度為40℃，隨著處理溫度的升高，三者酶活逐漸降低，酶活損失率也越多，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，酶A損失率到達(dá)50%以上，酶C損失率為80%以上，而脂肪酶B僅為18.12%，且得知在不同的溫度處理下三者相對(duì)酶活大小均為：B＞A＞C，B的穩(wěn)定性較好，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，相對(duì)酶活保持在80%以上（見(jiàn)圖1）。

表1 不同溫度處理對(duì)脂肪酶酶活的影響

圖1 不同溫度處理對(duì)脂肪酶相對(duì)酶活的影響

2.2 不同pH值處理對(duì)脂肪酶酶活的影響

不同pH值處理對(duì)脂肪酶酶活的影響見(jiàn)表2。由表2可知，脂肪酶A、B和C的最適pH值為7.5，隨著pH值的降低，三者酶活逐漸降低，當(dāng)pH值在3.0～4.0時(shí)，A、B酶活損失率達(dá)50%以上，C酶活幾乎消失，因此，在pH值由7.5降低到3.0時(shí)，A、B和C酶活的穩(wěn)定性變化較大，其中C酶穩(wěn)定性最差，A次之，B略好（見(jiàn)圖2）。

3 討論

3.1 溫度對(duì)脂肪酶酶活的影響

表2 不同pH值處理對(duì)脂肪酶酶活的影響

圖2 不同pH值處理對(duì)脂肪酶相對(duì)酶活的影響

目前酶的耐溫性能一直是飼料用酶關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，在飼料制粒、膨化過(guò)程中溫度可達(dá)70℃以上，在伴有高溫高壓的條件下，大多數(shù)酶制劑等熱敏性成分會(huì)因加工造成大量損失[7]，因此溫度對(duì)飼用酶制劑的活性造成的影響需要加以評(píng)估。隨著對(duì)脂肪酶研究的深入，其穩(wěn)定性和活性就成為當(dāng)今酶制劑領(lǐng)域需要關(guān)注的問(wèn)題，研究表明，大多數(shù)脂肪酶最適作用溫度為38～45℃。

由于飼料在制粒過(guò)程中物料的水分含量在15%～18%之間，因此有人認(rèn)為酶在液體狀態(tài)下的失活并不等于在飼料加工條件下也能失去相應(yīng)的活力。周響艷等模擬飼料制粒過(guò)程中調(diào)制器內(nèi)物料的水分含量，調(diào)整酶的水分為16%的情況下，對(duì)木聚糖酶進(jìn)行高溫處理，發(fā)現(xiàn)酶活損失較小，而在極端的液體狀態(tài)下進(jìn)行高溫處理后酶活損失很大[8]，與以上說(shuō)法一致。本研究中選用三種來(lái)自不同廠家的脂肪酶A、B和C，在液體狀態(tài)下用不同的溫度進(jìn)行處理5 min后測(cè)定其酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一種脂肪酶在不同溫度和不同的脂肪酶在同一種溫度下，其酶活損失差異都比較大，當(dāng)處理溫度由50℃升高到80℃時(shí)，脂肪酶B的酶活損失率由6%增加至18%，而A由20%增加至50%，C由70%增至80%；在80℃處理后，B的酶活保留率為80%，而A保留率不足50%，C不足20%，但這是否意味著在飼料加工狀態(tài)下也能失去相應(yīng)的活力，有待進(jìn)一步深入探討。

3.2 pH值對(duì)脂肪酶酶活的影響

飼料中脂肪酶必須要經(jīng)過(guò)胃腸道的酸性條件及內(nèi)源酶的水解達(dá)到作用位點(diǎn)，并在作用位點(diǎn)的pH值范圍內(nèi)具有較高的活性，因此，飼料用酶需要重點(diǎn)考慮酶的耐酸堿功能。pH值主要通過(guò)改變酶蛋白的三維構(gòu)象而影響酶活。脂肪酶的活力受pH值影響很大，pH值的變化可影響酶活性中心部位活性集團(tuán)的解離，從而影響酶與底物的結(jié)合或催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物[7]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)pH值由7.5降至3.0時(shí)，處理2 h后脂肪酶A、B和C酶活損失均很大，當(dāng)pH值處理值為3.0時(shí)，酶A和B的酶活損失率均達(dá)70%，酶C的酶活幾乎消失。

4 結(jié)語(yǔ)

脂肪酶的穩(wěn)定性是評(píng)定其產(chǎn)品質(zhì)量的最關(guān)鍵因素。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，影響脂肪酶穩(wěn)定性的因素很多，本文就不同溫度和pH值處理?xiàng)l件對(duì)脂肪酶酶活的影響進(jìn)行了探討，對(duì)不同來(lái)源的脂肪酶耐溫性和耐酸性作了初步的對(duì)比評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的脂肪酶穩(wěn)定性存在較大差異，因此選擇適合飼料各種加工生產(chǎn)條件和動(dòng)物消化道環(huán)境的酶是最關(guān)鍵的，有待通過(guò)動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)作進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，在實(shí)際生產(chǎn)中，還需要考慮充分評(píng)估脂肪酶的潛在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。