酵母水解物對異育銀鯽生長和免疫性能的影響

■楊 凡 陳昌福 易建華聶 琴胡駿鵬 李 彪

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070）

近年來，魚粉價格一直較高，飼料配方成本不斷提升，為降低配方成本，飼料中使用植物蛋白源更為頻繁，在原有配方基礎(chǔ)上下調(diào)魚粉含量后，若單純用植物蛋白填補原有配方中缺失的蛋白，往往會造成飼料適口性差、腸道組織易損傷、魚體生長緩慢等問題。為有效解決該問題，眾多學(xué)者和專家都在尋找良好的優(yōu)質(zhì)蛋白源原料，以期在減少魚粉用量時能穩(wěn)定飼料品質(zhì)，保持飼料較好的適口性和促生長效益[1-5]。酵母源產(chǎn)品在水產(chǎn)中已經(jīng)有了許多研究，主要集中在作為添加劑的功能性應(yīng)用研究中[6-9]。近年來，廣大研究學(xué)者開始關(guān)注并研究酵母源產(chǎn)品作為大原料發(fā)展的可能性；同時，酵母源產(chǎn)品（酵母水解物、酵母細胞壁多糖、酵母粉等）于2013年12月列入《飼料原料目錄》，豐富了國內(nèi)飼用原料的選擇。酵母水解物是以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為菌種，經(jīng)液體發(fā)酵得到的菌體，再經(jīng)自溶或外源酶催化水解后，濃縮或干燥獲得的產(chǎn)品。酵母水解物產(chǎn)品中的酵母可溶物未經(jīng)提取，保留了完整的細胞質(zhì)營養(yǎng)，富含蛋白、核苷酸、小肽、游離氨基酸和B族維生素，營養(yǎng)吸收利用率高。由于酵母水解物具有強烈鮮味，誘食作用明顯，且能滿足腸道、肝臟等代謝旺盛組織生長發(fā)育時的核苷酸營養(yǎng)需求，可用于替代飼料中的部分優(yōu)質(zhì)動物蛋白。本試驗采用植物性蛋白源豆粕配合酵母水解物使用來降低魚粉的用量，在等氮條件下研究經(jīng)優(yōu)化后的試驗配方對異育銀鯽幼魚生長性能的影響，以期為異育銀鯽低魚粉人工配合飼料的開發(fā)提供參考。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗飼料的設(shè)計與制備

以魚粉為動物蛋白源，豆粕為植物蛋白源，試驗飼料配方及營養(yǎng)水平如表1所示。試驗共設(shè)置5組，即：對照組、試驗組1、試驗組2、試驗組3和負對照組。其中試驗組1、試驗組2、試驗組3為魚粉替代組，飼料配方中按比例降低魚粉用量，同時增加豆粕和酵母水解物用量（酵母水解物由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)）。負對照組不添加酵母水解物。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)水平

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗在江蘇射陽異育銀鯽精養(yǎng)池網(wǎng)箱（2.0 m×2.0 m）中進行，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)投放相同大小及數(shù)量的異育銀鯽幼苗[（63±1.56）g]，每個重復(fù)40尾。暫養(yǎng)1周后，待魚攝食正常開始飼養(yǎng)試驗。飼養(yǎng)試驗共56 d。日投喂3～4次，投喂量為各試驗組魚體體重的2%，依據(jù)魚的攝食情況調(diào)整投餌量。試驗期間水溫20～28 ℃。DO＞6.0 mg/l，pH值(7.5±0.2)，NH3-N濃度為(0.25±0.05)mg/l，NO2-N濃度為(0.04±0.01)mg/l，硫化物＜0.05 mg/l，各項指標(biāo)均符合養(yǎng)殖水體要求。

1.3 測定與計算

1.3.1 樣品采集及測定

養(yǎng)殖試驗正式開始前，記錄每口池塘的投苗數(shù)量和投苗總重量。試驗結(jié)束后，計算存活率、增重率。從每個池塘取30尾魚測定試驗結(jié)束時體重，量體長，計算肥滿度；常規(guī)解剖分離內(nèi)臟團，測定魚體空殼重量，計算內(nèi)臟指數(shù)。

1.3.2 魚的生長及飼料利用計算

飼養(yǎng)試驗結(jié)束將魚饑餓24 h，記錄每個魚箱中魚的尾數(shù)，測定魚的體重和體長，計算成活率、肥滿度、增重率、內(nèi)臟指數(shù)、特定生長率、餌料系數(shù)。

成活率(%)=100×(存活尾數(shù)/放養(yǎng)尾數(shù))；

增重率(%)=100×（末均重-初均重）/初均重；

肥滿度(g/cm3)=100×試驗?zāi)w重/試驗?zāi)w長3；

臟體比(%)=100×內(nèi)臟團重/體重；

特定生長率(%/d)=100×(ln末均重-ln初均重)/試驗天數(shù)；

飼料系數(shù)=總攝食量/魚體凈增重。

1.3.3 免疫指標(biāo)測定

1.3.3.1 采血

于投喂免疫增強劑開始后，每周從各組中分別隨機撈取5尾供試魚，斷尾取血。將每尾魚的血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備抗凝血，供檢測白細胞吞噬活性；將另一份血液首先在室溫下靜置1 h待其凝固，置4℃冰箱保持4 h后，于4℃條件下以4 000 r/min離心10 min，收集上層血清，保存在4℃冰箱中，備用。

1.3.3.2 溶菌酶活性的測定

用0.067 mol/l的磷酸緩沖液(PBS，pH值6.4)將溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2 mg/ml的菌懸液。每個樣品取3.0 ml菌懸液，吸取血清40 μl加入到菌懸液中，混勻后，立刻在540 nm下測定A0值。然后在28℃水浴中溫育30 min，取出后置于4℃冰浴中終止反應(yīng)，再測定A值。按公式計算溶菌酶的活性：U=（A0-A）/A。

1.3.3.3 白細胞吞噬活性的測定

在0.2 ml抗凝血中加入0.1 ml F-SA，搖勻，在28℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動1次。用吸管吸取血細胞涂片，每個樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗風(fēng)干后，鏡檢，并計算白細胞吞噬百分比（Phagocytic percentage，PP）和吞噬指數(shù)（Phagocytic index，PI）。

1.3.3.4 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定

采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所產(chǎn)品）測定。

1.3.3.5 血清中總蛋白含量的測定

采用血清總蛋白試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所產(chǎn)品）測定。

1.3.3.6“鰓出血”組織漿的制備與攻毒

具有典型“鰓出血病”的銀鯽來源于江蘇省鹽城地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖場。在無菌條件下，取患病銀鯽病魚的鰓、腎、脾、肝和顯癥肌肉、腸等組織，稱重后剪碎并經(jīng)過勻漿機勻漿后，加入0.85%無菌生理鹽水，以雙層紗布過濾并在低溫下以3 000 r/min離心0.5 h，取上清液以無菌生理鹽水調(diào)節(jié)至10-1的組織濃度。

從各組網(wǎng)箱中隨機撈取30尾供試魚，經(jīng)胸鰭基部對每尾魚注射0.3 ml的病魚組織勻漿液后，放在塑料水族箱中繼續(xù)飼養(yǎng)觀察14 d。對死亡的異育銀鯽進行解剖觀察，判斷是否由人工感染致死，統(tǒng)計各組的死亡率，依下式計算免疫保護率（Relative percent survival,RPS）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 16.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和T檢驗，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同飼料對異育銀鯽生長性能的影響

經(jīng)過56 d的正式養(yǎng)殖試驗。得到各養(yǎng)殖試驗組的生長速度，結(jié)果見表2。由表2可知，0.5%和1%酵母水解物組增重率比對照組分別提高2.24%和8.16%，負對照組則比對照組略有下降(3.68%)，且1%酵母水解物組特定生長率最高，負對照組為最低；1%組飼料系數(shù)相比于對照組降低了8.65%；然而各組在增重率、特定生長率和飼料系數(shù)上與對照組均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 不同飼料對異育銀鯽形體指標(biāo)的影響（見表3）

由表3可以看出，不同飼料對異育銀鯽的肥滿度和臟體比均沒有產(chǎn)生顯著性差異(P＞0.05)，肥滿度值均在2.6～2.8之間，其中負對照組的肥滿度為最高，臟體比為各組最低。

表2 酵母水解物對異育銀鯽生長性能的影響

表3 酵母水解物對異育銀鯽形體指標(biāo)的影響

2.3 血液免疫指標(biāo)

2.3.1 溶菌酶活性和白細胞吞噬活性的變化（見表4）

表4 異育銀鯽血清中溶菌酶活性和白細胞吞噬活性

從表4可以看出，試驗組魚體溶菌酶活性與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。白細胞吞噬活性的測定結(jié)果表明，試驗組白細胞的PP和PI均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3.2 血清總蛋白和血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化（見表5）

表5 異育銀鯽血清總蛋白含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性

從表5中可以看出，試驗組魚體的血清中總蛋白含量隨著酵母水解物在飼料中添加量的增加而提高，但與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。對血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定結(jié)果表明，在飼料中添加酵母水解物可以降低異育銀鯽血清中血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性，但是,試驗魚與對照組魚之間未出現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。

2.3.3 攻毒后異育銀鯽的存活率（見表6）

表6 活菌攻毒后異育銀鯽的死亡率和免疫保護率

從表6可以看出，經(jīng)過不同方法接種后的異育銀鯽顯示出了比較一致的死亡趨勢，各組間免疫保護率沒有顯著性差異。

3 討論

本試驗中隨著使用酵母水解物配合豆粕用量的逐漸增大，異育銀鯽的生長性能呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，在1%酵母水解物組效果最好，負對照組為最低。分析為隨著魚粉被替代量的增加，豆粕使用量加大會影響飼料的利用率，進而影響魚的生長。吳莉芳等(2008)使用大豆蛋白進行魚粉替代試驗的研究表明，大豆蛋白替代魚粉蛋白的最適量為15%，最大替代量為45%；過量添加大豆蛋白將影響鯉魚的生長及飼料轉(zhuǎn)化率[10]。王永玲等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)周期的延長，豆粕等植物性蛋白會在一定程度上對異育銀鯽的腸道結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，特別是高含量組[11]；酵母水解物含有50%的粗蛋白，氨基酸組成平衡，且富含呈味的呈味核苷酸二鈉（I+G）和風(fēng)味氨基酸，兩者的協(xié)同作用能夠顯著提高飼料的適口性，改善水產(chǎn)動物的攝食。陳昌福等(2007)的試驗表明,將適量的酵母水解物添加在中華鱉成鱉的餌料中，對中華鱉成鱉具有明顯的誘食效果[12]；而且酵母水解物中含有6%～8%的核酸類物質(zhì)，能夠改善腸道結(jié)構(gòu)，修復(fù)腸道損傷。朱天和等(2010)研究表明，在鯉魚日糧中添加一定量的核苷酸能夠改善腸道結(jié)構(gòu)[13]。趙貴萍(2008)的研究表明，添加酵母源物質(zhì)能夠顯著改善高豆粕飼料所帶來的機體腸道損傷[14]。

通過免疫指標(biāo)可以看出，添加1%酵母水解物的白細胞吞噬活性顯著高于正對照組，其他免疫指標(biāo)和攻毒效果與對照組相比無顯著性差異，說明該添加酵母水解物會在一定程度上提高異育銀鯽的免疫能力。細胞壁多糖能夠通過葡聚糖和甘露聚糖的雙重作用，提高動物體的免疫抗病能力，保證動物的健康養(yǎng)殖[15]。嚴(yán)晶等(2009)研究表明，在飼料中添加0.2%和0.3%的酵母細胞壁多糖能夠顯著提高斑點叉尾鮰的白細胞吞噬活性[16]。李桂峰等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，飼料添加了0.5%和0.8%酵母多糖的飼料能顯著提高赤眼鱒的SOD酶活性、溶菌酶活性、補體C3水平、白細胞吞噬活性、紅細胞等免疫功能[17]。

4 結(jié)論

酵母水解物可作為一種蛋白原料在異育銀鯽飼料中添加，能夠在降低部分魚粉的同時保障養(yǎng)殖效果，但其中詳細的作用機理及與其他動植物蛋白源配合的比例還需進一步研究。