維生素D受體TaqⅠ、ApaⅠ基因多態(tài)性與昆明漢族2型糖尿病腎病的相關(guān)性研究

韓 睿 董 霞 蘇炳馳 楊薇 劉 華 宋滇平.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院糖尿病科，云南昆明 65003；.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明 65003

維生素D受體TaqⅠ、ApaⅠ基因多態(tài)性與昆明漢族2型糖尿病腎病的相關(guān)性研究

韓 睿1董 霞1蘇炳馳1楊薇1劉 華2宋滇平1
1.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院糖尿病科，云南昆明 650032；2.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，云南昆明 650032

目的研究云南昆明地區(qū)漢族2型糖尿病患者維生素D受體基因TaqⅠ（rs731236）、ApaⅠ（rs7975232）與2型糖尿病腎?。―N）發(fā)病的相關(guān)性。 方法運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，對昆明漢族108例DN及180例糖尿病不伴腎?。∟DN）患者的維生素D受體（VDR）基因TaqⅠ、ApaⅠ基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，分析并比較其臨床資料、基因型頻率、等位基因頻率等。結(jié)果NDN患者TaqⅠ位點(diǎn)的基因型頻率分別為T/T 88.89%、T/t+t/t 11.11%,等位基因頻率分別為T 93.33%、t 6.67%，DN患者TaqⅠ位點(diǎn)的基因型頻率分別為T/T 94.44%、T/t+t/t 5.6%，等位基因頻率分別為T 97.22%、t 2.78%；NDN患者ApaⅠ位點(diǎn)的基因型頻率分別為a/a 45.60%、A/A+A/a 54.40%，等位基因頻率分別為A 32.22%、a 67.78%，DN患者ApaⅠ位點(diǎn)的基因型頻率分別a/a 51.85%、A/A+A/a 48.15%，等位基因頻率分別為A 25.00%、a 75.00%。兩組患者ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。②ApaⅠ位點(diǎn)的aa和Aa基因型是DN發(fā)生的危險因素（OR=6.313、5.525，P=0.018、0.034）。 結(jié)論aa和Aa基因型是DN發(fā)生的危險因素。

2型糖尿??；維生素D受體；基因多態(tài)性；糖尿病腎病

流行病學(xué)資料表明，約40%的糖尿病患者發(fā)生糖 尿病腎?。―N）[1]，而且DN的發(fā)生與血糖水平無關(guān)。Zhang等[2]研究表明，維生素D受體（VDR）基因敲除的糖尿病小鼠更易發(fā)展為嚴(yán)重的蛋白尿和腎小球硬化，提示VDR基因與DN的發(fā)生有關(guān)。本研究探討發(fā)生DN的危險因素及其易感基因，并從分子角度探討TaqⅠ、ApaⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與DN的關(guān)系，為進(jìn)一步探索DN的危險因子和篩查易感基因提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 （以下簡稱 “我院”）2010年11月～2012年8月住院治療的2型糖尿?。═2DM）患者288例，男150例，女138例；年齡22～75歲，平均（52.94±11.94）歲。所有對象均無血緣關(guān)系，無其他自身免疫性疾病病史。該研究經(jīng)我院倫理委員會通過，患者知情同意并簽署知情同意書。T2DM診斷參照1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。參考美國糖尿病協(xié)會推薦的DN診斷標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)尿白蛋白肌酐比值（albumin creatinine ratio，ACR）≥30 μg/mg即診斷為DN，隨機(jī)尿ACR＜30 μg/mg為糖尿病不伴腎?。∟DN）。排除DN合并發(fā)熱、尿路感染、尿路結(jié)石、急慢性腎炎、腎病綜合征、惡性腫瘤以及伴有大血管病變等病史者。且所有患者均給予口服降糖藥或接受胰島素治療，近3個月內(nèi)未接受葉酸、維生素B12治療。

1.2 研究指標(biāo)

采用問卷調(diào)查，包括人口學(xué)資料、個人疾病史、心腦血管疾病史等，采用標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范的方法測量研究對象的坐位血壓、身高、體重、腰圍、臀圍，并計算體重指數(shù)（BMI）、腰臀比（WHR）。兩組患者取空腹及餐后2 h靜脈血，測定血糖、血脂、胰島素、糖化血紅蛋白等。以上測定在日本奧林巴斯AU5400型全自動生化分析儀、FT-630G儀器上進(jìn)行，由專人負(fù)責(zé)，并進(jìn)行質(zhì)量控制。

建立了校內(nèi)實習(xí)基地，依托教學(xué)基地，加強(qiáng)將專業(yè)理論知識轉(zhuǎn)化為解決工作實際問題的能力，可以熟悉制造業(yè)、商業(yè)企業(yè)等工藝操作實際過程，彌補(bǔ)會計基礎(chǔ)和財務(wù)管理課程理論課表達(dá)中的不足，讓學(xué)生通過真實情景和過程提前進(jìn)入工作環(huán)境。

1.3.1 DNA提取 采集研究對象清晨空腹肘部靜脈血2 mL，用全血DNA抽提試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）提取血液基因組DNA，應(yīng)用Eppendorf AG分光光度計（德國）進(jìn)行DNA純度/濃度測定后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

[3]Vandevyver C，Wylin T，Cassiman JJ，et al.Influence of the vitamin D receptor gene alleles on bone mineral density in postmenopausal and osteoporotic women [J].J Bone Miner Res，1997，12（2）：241-247.

2.3 DN相關(guān)危險因素的Logistic回歸分析

1.3.4 ApaⅠ位點(diǎn)、TaqⅠ位點(diǎn)核苷酸直接測序 為驗證酶切結(jié)果，筆者將PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序（送北京百泰克生物技術(shù)有限公司檢測），酶切結(jié)果與直接測序結(jié)果一致，見圖1、2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，均檢驗其正態(tài)性，若為正態(tài)分布且方差齊則采用t檢驗，若不為正態(tài)分布，則采用秩和檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Logistic多元回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 基因突變分析 對144例入選患者進(jìn)行基因突變檢測，共檢測到33種突變基因，DNMT3A和IKZF1突變在CD56+組中分別為0例和6例(75.00%)，而在CD56-組分別為11例(100.00%)和2例(25.00%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.442、4.781；P=0.035、0.029；P<0.05)；除去以上2種突變基因，其他31種突變基因在CD56+組和CD56-組組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表6。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較

兩組在年齡、BMI、WHR、血糖、血脂、胰島素抵抗指數(shù)方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。DN組糖尿病病程顯著長于NDN組，SBP高于NDN組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

兩組患者ApaⅠ、TaqⅠ基因型以及等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 兩組患者ApaⅠ、TaqⅠ基因型以及等位基因頻率比較

采用儀器自帶鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液對電化學(xué)法進(jìn)行準(zhǔn)確性檢定，測得峰電位為-785mV，鎘含量為0.327mg/kg，符合儀器預(yù)設(shè)范圍。

1.3.3 酶切鑒定基因型 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用ApaⅠ、TaqⅠ限制性核酸內(nèi)切酶（由MBI Fermentas公司提供）酶切后，置于2%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。結(jié)果示：ApaⅠ位點(diǎn)中純合子AA基因型740 bp；純合子aa基因型520 bp和220 bp；雜合子Aa基因型740 bp、520 bp、220 bp。TaqⅠ位點(diǎn)中純合子TT基因型454 bp；雜合子Tt基因型454 bp、293 bp、161 bp；純合子tt基因型293 bp、161 bp。

以是否并發(fā)DN作為因變量，余指標(biāo)為自變量行Logistic回歸分析。結(jié)果提示SBP和ApaⅠ位點(diǎn)的aa、Aa基因型是發(fā)生DN的危險因素。見表3。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)DN的發(fā)生與維生素D的缺乏有關(guān)。在DN患者中，維生素D不足的發(fā)生率高達(dá)77.5%[5]。而維生素D是通過VDR來發(fā)揮其生物活性。故VDR基因的差異有可能是導(dǎo)致DN的主要原因之一，故DN的發(fā)生與VDR基因遺傳多態(tài)性有關(guān)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)VDR存在多種單核苷酸多態(tài)性（SNPs），且每種突變的發(fā)生頻率在人群中存在一定的地域、種族差異[6]。與糖尿病相關(guān)的SNPs主要集中在FokⅠ（rs2228570）、BsmⅠ（rs1544410）、ApaⅠ（rs797 5232）、TaqⅠ（rs731236）這4種基因。對于VDR基因四個常見變異位點(diǎn)而言，國內(nèi)外均有研究表明，外顯子起始密碼子的突變位點(diǎn)（FokⅠ）等位基因頻率在病例組與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)等位基因是DN的易感基因[7-8]，而BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)的基因型和等位基因型的差異一直存在爭議[9-10]。另有研究顯示[11]，在DN和NDN患者中，VDR基因在TaqⅠ外顯子9的等位基因中差異顯著，TaqⅠ基因及其功能多態(tài)性與DN的發(fā)病有關(guān)。高水平的1，25（OH）2D3能改善DN的進(jìn)展，但這種聯(lián)系能被FokⅠ多態(tài)性改變[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，DN組和NDN組患者ApaⅠ位點(diǎn)及TaqⅠ位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但進(jìn)一步的回歸分析顯示，ApaⅠ位點(diǎn)的aa和Aa基因型可能是發(fā)生DN的危險因素。其可能原因為ApaⅠ位點(diǎn)在VDR基因第9內(nèi)含子上，其突變影響VDR mRNA的穩(wěn)定性，從而影響血管緊張素系統(tǒng)的活性，參與DN的發(fā)生。但還需進(jìn)一步驗證。故進(jìn)一步研究VDR基因多態(tài)性與DN的關(guān)系對探索該基因與DN可能的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

首先，理想一致于信念。理想信念是具備中國特色的一個固定用法，我們絕對不能單獨(dú)強(qiáng)調(diào)其中之一，或者以偏概全。理想是面向未來，信念直指現(xiàn)在。共產(chǎn)黨員的追求，既是對未來的追求，也是對現(xiàn)實的追求。理想是信念的前提，信念是理想的基礎(chǔ)。就當(dāng)前來說，共產(chǎn)主義理想是中國特色社會主義信念的前提，中國特色社會主義信念是共產(chǎn)主義理想的基礎(chǔ)。堅持二者的統(tǒng)一性，不僅可以培養(yǎng)中共黨員實現(xiàn)共產(chǎn)主義理想的熱情和積極性，而且可以使他們堅定中國特色社會主義信念，促使他們在工作中勤奮踏實，自覺提高自身本領(lǐng)，穩(wěn)步邁向共產(chǎn)主義。

[2]Zhang Z，Sun L，Wang Y，et al.Renoprotective role of the vitamin D receptor in diabetic nephropathy[J].Kidney Int，2008，73（2）：163-171.

1.3.2 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增所使用的引物：①ApaⅠ位點(diǎn)[3]：上游引物5＇-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3＇，下游引物5＇-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3＇。②TaqⅠ位點(diǎn)[4]：上游引物5＇-CAGAGCATGGACAGG GAG-3＇，下游引物5＇-AGGAGAGGCAGCGGTACTG-3＇。PCR擴(kuò)增條件：①ApaⅠ位點(diǎn)：共35個循環(huán)：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)完成后，72℃再延伸6 min。②TaqⅠ位點(diǎn)：共35個循環(huán)：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s。反應(yīng)完成后，72℃再延伸5 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖泳后，以50 bp DNA Ladder Marker作為分子量參照物，用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照（ApaⅠ位點(diǎn)PCR產(chǎn)物片段長度為740 bp，TaqⅠ位點(diǎn)PCR產(chǎn)物目的片段長度為454 bp）。

眾所周知，農(nóng)村經(jīng)濟(jì)合作組織是獨(dú)立的法人實體，因此，在發(fā)展過程中應(yīng)該具有獨(dú)立的法人資格。在此種情況下，我國農(nóng)業(yè)部門要想讓農(nóng)村經(jīng)濟(jì)合作組織發(fā)揮出應(yīng)有的作用，就需要提高農(nóng)村經(jīng)濟(jì)合作組織的社會地位，讓其能夠與銀行組織、政府部門等其他組織進(jìn)行有效合作，從而有效縮小生產(chǎn)經(jīng)營風(fēng)險，提高勞動生產(chǎn)率，潛移默化中推動我國農(nóng)業(yè)實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，提高農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。

1.3 研究方法

[1]劉志紅.糖尿病腎病的遺傳背景研究[J].中華內(nèi)科雜志，2002，41（8）：561-562.

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[5]Zang L，F(xiàn)u P，Huang YQ，et al.Vitamin D deficiency and carotid artery intima-media thickness and coronary calcification in patients with diabetic nephropathy[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2012，43（3）：420-424，450.

將PBL教學(xué)法引入高等師范院校水文學(xué)教學(xué)中，以問題為基礎(chǔ)，以學(xué)生為主體，以教師為導(dǎo)向的啟發(fā)式教育，以培養(yǎng)學(xué)生的能力為教學(xué)目標(biāo)，發(fā)揮問題對學(xué)習(xí)過程的指導(dǎo)作用，調(diào)動學(xué)生的主動性和積極性．PBL教學(xué)模式的應(yīng)用可以讓學(xué)生在一個真實的情境中對驅(qū)動問題展開探究，從而解決問題，并在探究過程中學(xué)習(xí)及應(yīng)用學(xué)科思想．同時，學(xué)生要創(chuàng)制出一套能解決問題的可行產(chǎn)品，這樣也可以鍛煉彼此之間的團(tuán)隊協(xié)作能力，作為課堂學(xué)習(xí)的成果公開展示答辯，在展示答辯過程中培養(yǎng)學(xué)生的發(fā)問習(xí)慣，提升學(xué)生的講解思辨能力．PBL教學(xué)法作為一種有效提升學(xué)生綜合素質(zhì)能力，提升學(xué)生學(xué)習(xí)興趣的教學(xué)模式可以在高等院校水文學(xué)教學(xué)中推廣．

秦鐵崖聽喬十二郎介紹自己是他表姐夫的好朋友，既感到滑稽，也感到溫暖，隨即對老太醫(yī)說：“不用客氣，飲茶清談，也很不錯?！?/p>

[6]Van Belle TL，Gysemans C，Mathieu C.Vitamin D and diabetes：the odd couple[J].Trends Endocrinol Metab，2013，24（11）：561-568.

[7]常永麗.維生素D受體FokⅠ基因多態(tài)性與內(nèi)蒙古地區(qū)蒙漢人群糖尿病腎病的相關(guān)性研究[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（8）：1243-1245.

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[9]Zhou TB，Jiang ZP，Li AH，et al.Association of vitamin D receptor FokⅠ（rs2228570），TaqⅠ（rs731236）and ApaⅠ（rs7975232）gene polymorphism with the risk of chronic kidney disease[J].J Recept Signal Transduct Res，2014，22：1-8.

[10]Liu ZL，Liu L，Chen X，et al.Associations study of vitamin D receptor gene polymorphisms with diabetic microvascular complications：a meta-analysis[J].Gene，2014，546（1）：6-10.

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

[11]Nosratabadi R，Arababadi MK，Salehabad VA，et al.Polymorphisms within exon 9 but not intron 8 of the vitamin D receptor are associated with the nephropathic complication of type-2 diabetes[J].Int J Immunogenet，2010，37（6）：493-497.

[12]Yokoyama K，Nakashima A，Urashima M，et al.Interactions between serum vitamin D levels and vitamin D receptor gene FokⅠpolymorphisms for renal function in patients with type 2 diabetes[J].PloS one，2012，7（12）：e51171.

Association between TaqⅠ ,ApaⅠ of Vitamin D receptorgene polymorphism and type 2 diabetic nephropathy of the Han Nationality in Kunming

HAN Rui1DONG Xia1SU Bingchi1YANG Wei1LIU Hua2SONG Dianping1
1.Department of Diabetes,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Yunnan Province,Kunming 650032,China;2.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Yunnan Province,Kunming 650032,China

ObjectiveTo investigate the relationship between TaqⅠ(rs731236),ApaⅠ(rs7975232)and type 2 diabetic nephropathy of the Han Nationality in Yunnan area of Kunming.Methods PCR-RFLP technique was used to detected TaqⅠ,ApaⅠof Vitamin D receptor gene polymorphism in 108 patients with diabetic nephropathy and 180 patients without nephropathy.The clinical data,genotype frequencies,allele frequencies were analyzed and compared. Results①Genotype frequency of TaqⅠ loci in NDN patients were T/T 88.89%and T/t+t/t 11.11%,allele frequency were T 93.33%and t 6.67%,respectively,genotype frequency of TaqⅠloci in DN patients were T/T 94.44%and T/t+ t/t 5.6%,allele frequency were T 97.22%and t 2.78%,respectively;genotype frequency of ApaⅠ loci in NDN patients were a/a 45.60%,A/A+A/a 54.40%,allele frequency were A 32.22%and a 67.78%,respectively,,genotype frequency of ApaⅠloci loci in DN patients were a/a 51.85%and A/A+A/a 48.15%,allele frequency were A 25.00%and a 75.00%,respectively.Comparison between two groups of patients with ApaⅠ,TaqⅠloci of genotype frequency and allele frequency,there were no statistically significant difference (all P＞0.05).②aa and Aa genotype in ApaⅠ were risk factors of DN(OR=6.313,5.525;P=0.018,0.034).Conclusion aa and Aa genotypes are risk factors of DN.

Type 2 diabetes;Vitamin D receptor;Gene polymorphism;Diabetic nephropathy

R744.51

A

1673-7210（2015）03（c）-0069-04

2014-12-25本文編輯：衛(wèi) 軻）

云南省科技計劃項目（編號2009CD086）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項目（編號2013Y286）；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項基金項目（編號2014 FB029）。