細(xì)胞型FLICE樣抑制蛋白、T-box轉(zhuǎn)錄因子在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義

張穎奇 李 華 徐 波 滿 一 劉微麗

1.中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院口腔科，河北廊坊 065000；2.中國石油天然氣集團(tuán)公司中心醫(yī)院介入導(dǎo)管室，河北廊坊 065000；3.鄭州人民醫(yī)院口腔科，河南鄭州 450000

口腔鱗狀細(xì)胞癌 （oral squamous cell carcinoma，OSCC）是一種常見于口腔頜面部的惡性腫瘤，在口腔頜面部惡性腫瘤中占有相當(dāng)高的比例，每年有幾十萬人患病，威脅著人們的生活質(zhì)量及生命，是一種嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病[1-2]。而腫瘤的發(fā)生是內(nèi)外界因素長期作用于人體細(xì)胞的結(jié)果，因此，學(xué)者認(rèn)為口腔頜面部腫瘤是危害人們健康及生活質(zhì)量的一種慢性病。而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的過程中可能有多個(gè)因素及多種機(jī)制的參與，如不良生活習(xí)慣、理化因素、機(jī)械刺激因素、生物學(xué)因素以及基因突變[3-4]。研究表明，細(xì)胞型FLICE樣抑制蛋白（cFLIP）及T-box轉(zhuǎn)錄因子（TBX2）在多種腫瘤組織中表現(xiàn)為高表達(dá)，故深入探討兩者在腫瘤中的作用，有助于OSCC的防治。

1 材料與方法

1.1 病例選擇及分組標(biāo)準(zhǔn)

標(biāo)本來源:由吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院及鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供。選擇病例標(biāo)準(zhǔn):所有病例術(shù)前未行放療、化療等任何治療。術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)確診。其中男37例，女20例；年齡40～73歲，中位年齡66歲；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9例；臨床分期分為Ⅰ期5例、Ⅱ期7例、Ⅲ期26例、Ⅳ期19例[國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年分期標(biāo)準(zhǔn)]。另外部分取口腔黏膜上皮異常增生（DOM）組織（位于癌變組織與正常黏膜交界部位，組織學(xué)表現(xiàn)為不典型增生）38例，男21例，女17例；取距離癌腫邊緣 5 cm處的正常口腔黏膜（NOM）30例，男15例，女15例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

鼠抗人單克隆抗體c-FLIP和TBX2。生物素化兔抗山羊二抗IgG、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、Trizol試劑；M.MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，Oligo（dT）12-18 引物，TagDNA聚合酶，硝酸纖維素膜，羊抗兔β-actin抗體，預(yù)染蛋白marker，BCATM蛋白定量試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)方法

1.3.1.1 處理組織切片，固定，標(biāo)本染色:加入1∶150的一抗cFLIP/TBX2的單抗，4℃過夜。加入生物素化二抗工作液，置室溫下20 min，PBS漂洗后加入試劑SP，室溫下20 min，PBS洗后經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.3.1.2 結(jié)果判斷。采用顯微鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野（每個(gè)視野可見細(xì)胞數(shù)目≥200個(gè)）。鏡下免疫組化陽性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈顆粒樣、棕黃色。結(jié)果判定:①0分=細(xì)胞無染色；1分=細(xì)胞呈淺黃色；2分=細(xì)胞呈棕黃色；3分=細(xì)胞呈棕褐色。②1分=陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比＜30%；2分=陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比為30%～70%；3分=陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比＞70%。總積分=①、②兩項(xiàng)評分的乘積；陰性結(jié)果（-）:0～1 分，陽性結(jié)果（＋）:≥2 分。

1.3.2 RT-PCR法

1.3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成。

1.3.2.2 提取組織總RNA。采用Trizo試劑進(jìn)行提取，其優(yōu)點(diǎn)是RNA不易降解，且提取的RNA純度較好。步驟如下:裂解組織，RNA抽提，RNA沉淀，RNA洗滌，RNA溶解。測定總RNA濃度和純度的:空白對照是DEPC-H2O。

1.3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄（RT）以mRNA為模板，合成單鏈cDNA。

1.3.2.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在相應(yīng)的反應(yīng)條件經(jīng)過變形-退火-延伸下進(jìn)行PCR，然后定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件錄入、處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 cFLIP和TBX2在三種組織中的表達(dá)情況

顯微鏡下:cFLIP和TBX2的陽性表達(dá)呈棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)；cFLIP的陽性表達(dá)率:OSCC為91.23%，DOM為84.21%，NOM為10.00%。cFLIP在OSCC、DOM兩種組織中的表達(dá)較高，而cFLIP在NOM表達(dá)相對較低；OSCC、DOM與NOM的cFLIP表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），OSCC與 DOM的cFLIP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TBX2的陽性表達(dá)率:OSCC為87.72%，DOM為81.58%，NOM為26.67%。TBX2在OSCC、DOM兩種組織中的表達(dá)較高，而TBX2在NOM相比較相對較低，OSCC、DOM與NOM的TBX2表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），而OSCC、DOM比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見表 1。

表1 cFLIP和TBX2在OSCC、DOM及NOM蛋白中的表達(dá)（例）

2.2 cFLIP和TBX2在三種組織中的表達(dá)情況與OSCC臨床之間的關(guān)系

本研究表明，OSCC的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與cFLIP和TBX2表達(dá)程度有關(guān)，在這兩個(gè)方面的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 cFLIP、TBX2與OSCC臨床特征關(guān)系（例）

2.3 OSCC、DOM和NOM三種組織中cFLIP mRNA、TBX2 mRNA的表達(dá)情況

OSCC、DOM兩種組織中cFLIP mRNA的表達(dá)較高，而NOM的cFLIP mRNA較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）； 同時(shí)，OSCC、DOM 之間的 cFLIP mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。在OSCC、DOM和NOM三種組織中TBX2 mRNA的表達(dá):三種組織中，TBX2的表達(dá)由高到低依次是OSCC、DOM和NOM，其中OSCC與DOM、OSCC與NOM間的TBX2 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；而DOM與NOM之間的TBX2 mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。見表 3。

表3 OSCC、DOM和NOM三種組織中cFLIP mRNA、TBX2 mRNA 的表達(dá)情況（±s）

表3 OSCC、DOM和NOM三種組織中cFLIP mRNA、TBX2 mRNA 的表達(dá)情況（±s）

注:與 NOM 比較，aP ＜ 0.05；與 DOM 比較，bP ＜ 0.05；cFLIP:細(xì)胞型FLICE樣抑制蛋白；TBX2:T-box轉(zhuǎn)錄因子；OSCC:口腔鱗狀細(xì)胞癌；DOM:口腔黏膜上皮異常增生；NOM:正?？谇火つ?/p>

組織類型 例數(shù) cFLIP mRNA TBX2 mRNA OSCC DOM NOM 5738300.43±0.16ab 0.21±0.11a 0.09±0.070.51±0.20ab 0.26±0.170.19±0.11

2.4 cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表達(dá)與OSCC臨床特征的關(guān)系

結(jié)果表明OSCC的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表達(dá)情況有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 cFLIP、TBX2在OSCC中的相關(guān)性

經(jīng)過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，cFLIP、TBX2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.768，P ＜ 0.05）。

表4 cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表達(dá)與OSCC臨床特征的關(guān)系（±s）

表4 cFLIP mRNA和TBX2 mRNA的表達(dá)與OSCC臨床特征的關(guān)系（±s）

注:與Ⅰ+Ⅱ期比較，*P ＜ 0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，▲P ＜ 0.05；cFLIP:細(xì)胞型FLICE樣抑制蛋白；TBX2:T-box轉(zhuǎn)錄因子；OSCC:口腔鱗狀細(xì)胞癌

臨床特征 cFLIP蛋白 P值 TBX2蛋白 P值年齡＜60歲≥60歲性別0.200.653.46±2.214.32±2.363.25±2.193.38±2.320.910.87男女3.98±2.294.57±2.103.47±1.893.31±1.16臨床分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況0.010.032.34±2.064.53±2.17*2.18±1.674.08±2.36*0.020.04無有2.87±2.184.67±2.16▲3.09±2.114.51±2.21▲

3 討論

世界衛(wèi)生組織（WHO）明確定義惡性腫瘤是一種慢性病，而口腔頜面部最為常見的惡性腫瘤——鱗狀細(xì)胞癌的形成也是一個(gè)長期的生物學(xué)過程，其特點(diǎn)是多步驟、多病灶性。因此我們可根據(jù)慢性病的特點(diǎn)，采取更合理、更有效的治療措施。目前國內(nèi)外高度重視惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究，尤其是其發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)化的研究；隨著分子生物技術(shù)的飛速提高，大量的腫瘤標(biāo)志物、癌基因被發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用于臨床診斷、治療之中，取得了較好的效果。常見的癌基因:Ras基因，抑癌基因:p53基因、RB基因等。研究表明:腫瘤發(fā)生時(shí)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)——脫氧核糖核酸（DNA）產(chǎn)生突變，細(xì)胞的生長和分裂失衡，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生，凋亡失衡。在這個(gè)過程之中癌基因和抑癌基因發(fā)揮重要的作用。1997年Irmler發(fā)現(xiàn)了cFLIP，它是一種凋亡調(diào)控蛋白[5]，定位于人類染色體2q33-34，其蛋白的主要表達(dá)為cFLIPL和cFLIPS，前者的分子量較大，后者的較?。豢梢栽谌祟惖炔溉閯?dòng)物中存在，可以在正常組織中表達(dá)，例如肌肉、淋巴組織中等[6]。組織在炎癥狀態(tài)下cFLIP的表達(dá)水平會有所增加，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的趨化功能，清除壞死細(xì)胞及組織[7]；同時(shí)，炎癥細(xì)胞能誘導(dǎo)cFLIP的表達(dá)水平增高，影響細(xì)胞凋亡。cFLIP可以抑制Fas及其他死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（如 TNFR、DR3、DR6 等），誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。 而 Fas蛋白信號通路在腫瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要的作用。cFLIP 內(nèi)含有死亡效應(yīng)域（death effect domain，DED）；DED可以與死亡效應(yīng)分子和Caspase-8結(jié)合，阻止了死亡 信號 復(fù) 合體 （death-induced signal complex，DISC）的形成，進(jìn)而阻斷了Fas蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，形成腫瘤組織。通過小鼠實(shí)驗(yàn)表明cFLIP轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞能夠躲避機(jī)體的免疫監(jiān)視，且與Fas蛋白信號通路有關(guān)。研究表明，cFLIP在腸上皮癌[8]、膀胱上皮癌組織[9]、胃癌組織[10]及淋巴瘤組織[11-13]中表達(dá)顯著增高，明顯高于正常組織。本研究發(fā)現(xiàn)cFLIP及cFLIP mRNA在鱗癌組織中表達(dá)較高，明顯高于NOM；另外，其表達(dá)情況與OSCC的臨床分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與年齡、性別之間的差異無關(guān)。有研究表明在Kaposi肉瘤中cFLIP的臨床表達(dá)，提示了cFLIP在OSCC的發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。T-box基因是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，TBX2是其重要的一員，在胚胎的發(fā)育形成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，同時(shí)還參與許多器官的形態(tài)發(fā)生，如肺、腎臟、乳腺間質(zhì)、心臟、原腸形成以及黑色素細(xì)胞等[14-21]。研究表明TBX2在多種腫瘤中表達(dá)較高[22]，本研究與之相符。其機(jī)制可能是抑制p19arf蛋白的表達(dá)，破壞細(xì)胞的正常凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖。也有人認(rèn)為TBX2可以與Myc、Ras等癌基因發(fā)揮相互協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展；TBX2可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性而維持腫瘤的生長。在相關(guān)性分析中，cFLIP、TBX2的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者之間可能互相促進(jìn)OSCC的發(fā)生發(fā)展，印證了腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多個(gè)基因共同調(diào)控的結(jié)果；但是具體機(jī)制需要進(jìn)行深入的研究。

綜上所述，我們可以考慮將cFLIP、TBX2作為治療靶點(diǎn)，研究選用對兩者敏感或針對性強(qiáng)的藥物進(jìn)行治療，提高臨床療效。因此，對cFLIP、TBX2的深入研究有助于OSCC的早期診斷、有效治療及預(yù)后評估。

[1]孔維佳.耳鼻咽喉科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:254.

[2]邱蔚六.口腔頜面外科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:274.

[3]呂曉智，殷學(xué)民，馮元勇，等.骨橋蛋白mRNA在口腔鱗癌與正常黏膜中的表達(dá)及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（7）:1165-1167.

[4]呂曉智，鄒亞光，殷學(xué)民，等.MMP1 mRNA在口腔鱗癌與正常黏膜中的表達(dá)及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（8）:1362-1364.

[5]Irmler M，Thome M，Hahne M，et al.Inhibition of death receptor signals by cellular FLIE [J].Nature，1997，388（6638）:190-195.

[6]Von Knebel Doeberitz M.New markers for cervical dysplasia to visualize the genomic chaos created by aberrant oncogenic papillomavirus infections[J].Eur J Cancer，2002，38（17）:2229-2242.

[7]Santiago B，Galindo M，Palao G，et al.Intracellular regulation of Fas-induced apoptosis in human fibroblasts by extracellular factors and cycloheximide[J].J Immunol，2004，72（1）:560-566.

[8]Ryu BK，Chi SG，Lee MG，et al.Increased expression of cFLIP-L in colonic adenocarcinoma[J].J Pathol，2001，194（1）:15-19.

[9]ZhouXD，YuJP，LiuJ，etal.OverexpressionofcelluarFLICE-inhibitory protein （FLIP）in gastric adenocareinoma[J].Clinical Science，2004，106（4）:397-405.

[10]KorkolopoulouP，GoudopoulouA，VoutsinasG，etal.c-FLIP expression in bladder urothelial carcinomas:its role in resistance to Fas-mediated apoptosis and clinicopathologic correlations[J].Urology，2004，63（1）:1198-1204.

[11]Thomas RK，Kallenbom A，Wickenhauser C，et al.Constitutive expression of c-FLIP in Hodgkin and Reed-Sternberg cells[J].Am J Pathol，2002，160（4）:1521-1528.

[12]Irisarri M，Plumas J，Bonnefoix T，et al.Resistance to CD95-mediated apoptosis through constitutive c-FLIP expression in a non-Hodgkin's lymphoma B cell line[J].Leukemia，2000，14（12）:2149-2158.

[13]Poulaki V，Mitsiades CS，Kotoula V，et al.Regulation of Apo2L/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand——induced apoptosis in thyroid carcinoma cells[J].Am J Pathol，2002，161（2）:643-654.

[14]Bilican B，Goding CR.Cell cycle regulation of the T-box transcription factor TBX2[J].Exp Cell Res，2006，312（12）:2358-2366.

[15]Jerome-Majewska LA，Jenkins GP，Ernstoff E，et al.Tbx3，the ulnar-mammary syndrome gene，and Tbx2 interact in mammary gland development through a p19Arf/p53-independent pathway[J].Dev Dyn，2005，234（4）:922-933.

[16]Lustig KD，Kroll KL，Sun EE，et al.Expression cloning of a Xenopus T-related gene（Xombi）involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation[J].Development，1996，122（12）:4001-4012.

[17]Kalinichenko VV，Lim L，Stolz DB，et al.Defects in pulmonary vasculature and perinatal lung hemorrhage in mice heterozygous null for the Forkhead Box f1 transcription factor[J].Dev Biol，2001，235（2）:489-506.

[18]Cho GS，Choi SC，Park EC，et al.Role of Tbx2 in defining the territory of the pronephric nephron [J].Development，2011，138（3）:465-474.

[19]Gibson-Brown JJ，Agulnik SI，Silver LM，et al.Involvement of T-box genes Tbx2-Tbx5 in vertebrate limb specificationanddevelopment[J].Development，1998，125（13）:2499-2509.

[20]Carreira S，Liu B，Goding CR.The gene encoding the T-box factor Tbx2 is a target for the microphthalmia-associated transcription factor in melanocytes[J].J Biol Chem，2000，275（29）:21920-21927.

[21]Harrelson Z，Kelly RG，Goldin SN，et al.Tbx2 is essential for patterning the atrioventricular canal and for morphogenesis of the outflow tract during heart development[J].Development，2004，131（20）:5041-5052.

[22]Teng H，Parker MI，Prince S.Functional characterization of cis-acting elements involved in basal transcription of the human TBX2 gene:a new insightinto the role of Sp1 in transcriptional regulation[J].Gene，2008，423（1）:8-13.