HBV進(jìn)入抑制劑研究近況與展望

周利婷，張四喜，馬威，張永凱

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130000)

?

HBV進(jìn)入抑制劑研究近況與展望

周利婷，張四喜，馬威，張永凱Δ

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，吉林 長春 130000)

鈉離子?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的受體，此發(fā)現(xiàn)為抗HBV新藥研發(fā)提供了新靶標(biāo)。本文綜合了近3年來對NTCP受體的研究，全面闡述了目前HBV治療中的瓶頸、NTCP發(fā)現(xiàn)的意義及其表達(dá)調(diào)節(jié)，以及進(jìn)入抑制劑的種類、作用機(jī)制和研究進(jìn)展。進(jìn)入抑制劑將成為抗HBV感染的新靶點(diǎn)，并有可能成為抗HBV感染的新的策略之一。

鈉離子?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽；乙型肝炎病毒；進(jìn)入抑制劑；綜述

Na+-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(Na+-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是HBV感染細(xì)胞的功能性受體，是2012年由北京生命科學(xué)研究所李文輝團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的[1]。近3年來，國內(nèi)外研究人員在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)受體及其進(jìn)入抑制劑(entry inhibitors)方面做了大量工作，HBV進(jìn)入抑制劑已成為新型抗HBV藥物研發(fā)的主流之一。本文針對近年來HBV受體及其進(jìn)入抑制劑的研究進(jìn)展作一綜述。

1 HBV治療現(xiàn)狀

HBV感染呈全球性分布，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌[2]。我國是乙肝的高流行區(qū)。目前，抗病毒治療是HBV感染患者治療的關(guān)鍵?？共《局委熕幬镏饕袃纱箢?，即干擾素(interferon， IFN)和核苷(酸)類似物(nucleoside (acid) analogues， NAs)，但由于HBV緩慢的病毒清除動力學(xué)和自發(fā)的基因變異性，使其抗病毒治療的臨床療效仍然不盡人意[3]。IFN治療中長期獲益僅有40%，且伴隨長期大劑量使用的副作用和費(fèi)用的增加；NAs可較快抑制病毒復(fù)制且不良反應(yīng)少，但由于NA的療程相對較長，病毒可在治療過程中出現(xiàn)適應(yīng)性變異并不可避免地導(dǎo)致耐藥[4]。所有核苷類似物在治療1～2年或更長時(shí)間內(nèi)均會篩選出耐藥突變株，導(dǎo)致藥物敏感性下降[5]。

2 NTCP的發(fā)現(xiàn)及調(diào)節(jié)

HBV感染過程包括進(jìn)入肝細(xì)胞、DNA復(fù)制、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA， cccDNA)儲存、抗原合成和病毒釋放。而HBV必須通過與細(xì)胞表面受體分子相結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的感染，因此，研究病毒入侵的機(jī)制，才有可能找到預(yù)防和治療乙型肝炎的有效方法。HBV表面蛋白包括3種，分別為大蛋白(LHBs)、中蛋白(MHBs)和小蛋白(SHBs)，其中包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：preS1、preS2和S。其中PreS1結(jié)構(gòu)域位于HBV的最外部，LHBs的PreS1區(qū)是介導(dǎo)HBV與受體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。2012年11月，北京生命科學(xué)研究所的Yan等在elife上首次提出，NTCP是HBV感染細(xì)胞的功能性受體[1]。HBV通過病毒LHBs蛋白的preS1區(qū)與肝細(xì)胞表面的NTCP發(fā)生特異性相互作用，介導(dǎo)HBV進(jìn)入肝細(xì)胞；作者在NTCP的跨膜結(jié)構(gòu)域中鑒定出了10aa長度的區(qū)域?yàn)橹苯优cPre-S1作用的結(jié)構(gòu)域，且將對HBV不易感的猴肝細(xì)胞上原本無受體功能的NTCP第157～165aa替換成人類序列后，可使猴感染HBV[6-7]。

NTCP(編碼基因?yàn)镾LC10A1)專屬分布于肝細(xì)胞基底膜，是最重要的膽鹽攝取系統(tǒng)，超過80%的結(jié)合型?；悄懰岷图s50%的游離型牛磺膽酸被NTCP以Na+依賴方式攝取入肝細(xì)胞[8]。除了內(nèi)源性膽汁酸可激活法尼醇X受體(farnesoid X receptor， FXR)，F(xiàn)XR通過誘導(dǎo)小異二聚體伴侶(small heterodimer partner， SHP)的表達(dá)間接抑制NTCP的表達(dá)外，某些藥物也能下調(diào)NTCP的表達(dá)。研究表明[9]，環(huán)孢素 A、哇巴因、維庫溴銨、孕烯醇酮硫酸酯、布美他尼、厄貝沙坦和依澤替米貝等可下調(diào)NTCP進(jìn)而干擾膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，雌激素、腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細(xì)胞介素1(IL-1、IL-6)等均可下調(diào)人肝細(xì)胞膜表面NTCP的表達(dá)，其中以IL-1的作用最為明顯，但這些因素是否對肝細(xì)胞感染 HBV 具有保護(hù)作用尚需相關(guān)研究進(jìn)一步明確[10]。

3 進(jìn)入抑制劑

3.1 Myrcludex B Myrcludex B是Vision 7 GmbH公司研制的乙?；疨reS1短肽，是第1個(gè)強(qiáng)力HBV入胞抑制劑。PreS1 2～48位氨基酸介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的接合，氨基酸乙?；腜reS1 2～48位短肽能夠抑制HBV感染正常肝細(xì)胞，Mrycludex B現(xiàn)已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)[2， 5， 11]。Myrcludex B和NTCP結(jié)合后在抑制HBV感染的同時(shí)也抑制了NTCP轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁酸的功能，可能使膽汁酸在血清的濃度升高而代償性地引起其他膽汁酸攝入轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)及功能上調(diào)，如有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporter polypeptides， OATP)[12-13]。但意外的是，Nkongolo等研究發(fā)現(xiàn)Myrcludex B鈍化NTCP的HBV受體功能所需的藥物濃度(IC50=80 pM)遠(yuǎn)低于阻斷其膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能所需的藥物濃度(IC50=52 nM)，因此可能存在一個(gè)較大的治療窗口，在該治療窗口內(nèi)，Myrcludex B既可阻斷HBV進(jìn)入肝細(xì)胞，且不影響NTCP的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能[14-16]。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，用合成的抗脂多糖肽在HBV感染前和感染中處理體外肝細(xì)胞，可降低HBV感染標(biāo)志物(即HBV DNA和HBsAg)。應(yīng)用4～5 g/mL劑量時(shí)，下降90%；0.5～2 g/mL劑量時(shí)，下降50%[17]。對慢性HBV和HDV感染的嵌合小鼠模型(chimaeric mouse model)進(jìn)行臨床前評價(jià)表明，Myrcludex B可完全阻斷HBV在細(xì)胞間傳播，并可預(yù)防人肝細(xì)胞被HDV感染[12， 18]。

3.2 環(huán)孢素A及其衍生物和依澤替米貝 Dong等[7]對72種食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市且可能下調(diào)肝細(xì)胞表面 NTCP 表達(dá)的藥物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)依澤替米貝和環(huán)孢素A對 HBV 進(jìn)入肝細(xì)胞有阻斷作用。環(huán)孢素A是1971年瑞士Sandoz公司從真菌(Tolypocladium iflatum Gams)分離提取出來的一種天然的親脂性環(huán)形11肽，具有強(qiáng)免疫抑制作用。環(huán)孢素A可抑制人肝細(xì)胞膜上的NTCP，不僅可以抑制膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)，而且同時(shí)抑制HBV進(jìn)入肝細(xì)胞。Nkongolo等[16]的體外實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)孢素 A可通過直接下調(diào)肝細(xì)胞膜表面的NTCP 來阻斷HBV進(jìn)入肝細(xì)胞。最近的2項(xiàng)研究表明，環(huán)孢素A直接作用于NTCP而影響HBV進(jìn)入肝細(xì)胞，此作用與親環(huán)蛋白相關(guān)，且在體外HepaRG細(xì)胞、原代人肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了人NTCP的HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A抑制HBV感染的IC50約為1 μM[16， 19]。而與環(huán)孢素A相比，其衍生物SCYX1454139的濃度為0.17 μM時(shí)即可阻斷HBV進(jìn)入肝細(xì)胞[19]。

研究對HBV進(jìn)入肝細(xì)胞有作用的另一種小分子物質(zhì)是依澤替米貝(ezetimibe)。依澤替米貝是一種膽固醇吸收抑制劑，可單獨(dú)使用發(fā)揮調(diào)脂作用，也可與他汀類合用，從不同的作用途徑降低原發(fā)性高膽固醇血癥患者的膽固醇水平。依澤替米貝還可通過作用于丙型肝炎(hepatitis C virus， HCV)感染過程中重要的蛋白NPC1L1(niemann-Pick C1-like 1)從而降低HCV的感染率[20-21]。研究表明，依澤替米貝能在HBV感染的早期發(fā)揮抑制作用[22]。這種對HBV病毒的抑制作用并不依賴于NPC1L1蛋白，研究表明此作用與依澤替米貝抑制NTCP有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)均表明依澤替米貝和環(huán)孢素A可有效阻斷 HBV 進(jìn)入肝細(xì)胞，在慢性乙型肝炎患者的治療中可能具有很好的應(yīng)用前景，但尚需動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證[19， 23-24]。

3.3 白細(xì)胞介素-6 白細(xì)胞介素-6(interleukin，IL)是一種多功能的細(xì)胞因子，主要在調(diào)節(jié)一些靶細(xì)胞包括肝細(xì)胞在內(nèi)的生物反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究表明，慢性HBV急性發(fā)作時(shí)血清IL-6濃度升高，是自身免疫系統(tǒng)對HBV的應(yīng)答，這種應(yīng)答是為了遏制HBV感染[25-26]。而對于IL-6在HBV感染中發(fā)揮的作用存在2種觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為IL-6可能是介導(dǎo)HBV感染的受體，另一種觀點(diǎn)表明IL-6可通過下調(diào)HBV受體NTCP的表達(dá)而抑制HBV感染。Neurath等研究表明，人IL-6可與HBV的pre-S1特異結(jié)合，從而提出了血液中的HBV顆?？赡芘cIL-6形成復(fù)合物，再通過肝細(xì)胞上的IL-6受體介導(dǎo)而后經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入肝細(xì)胞[27]。另有研究表明，IL-6可作為1個(gè)中間分子，通過結(jié)合HBV再通過HBV受體使HBV病毒進(jìn)入肝細(xì)胞[28]。但關(guān)于IL-6介導(dǎo)HBV感染的正確性尚缺乏有力的證據(jù)，待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。2015年Bouezzedine等[25]在研究IL-6對HBV進(jìn)入過程的影響中發(fā)現(xiàn)，體外預(yù)給予IL-6對HBsAg分泌的抑制率可達(dá)90%，且細(xì)胞內(nèi)HBV的cccDNA也顯著降低，同時(shí)NTCP的mRNA水平降低98%，NTCP介導(dǎo)的?；悄懰釘z取減少80%，且IL-6對NTCP及其攝取的抑制均具有劑量依賴性。這些結(jié)果證明IL-6通過下調(diào)NTCP從而抑制HBV進(jìn)入肝細(xì)胞，提示IL-6不僅可以作為HBV感染的指標(biāo)，而且可能通過干擾HBV進(jìn)入而發(fā)揮抗病毒活性?？傊?，關(guān)于IL-6介導(dǎo)HBV感染或是通過作用于NTCP抑制HBV感染的問題，有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

4 展望

對HBV受體的詳細(xì)闡明是分子病毒學(xué)家普遍感興趣的課題，伴隨HBV受體NTCP的發(fā)現(xiàn)，HBV進(jìn)入抑制劑的研究成為主流。HBV進(jìn)入抑制劑可通過直接抑制NTCP，從而阻斷病毒感染的首要進(jìn)入過程，阻斷HBV對新生肝細(xì)胞的再感染，為HBV的治療提供了一種新的思路，并有望成為將來根治 HBV 的新策略之一。但是目前對于HBV受體的研究仍處于初級階段，還存在很多問題或機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

[1] Yan H,Zhong GC,Xu GW,et al.Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and Dvirus[J].eLife,2012(1):e00049.

[2] Cheng JC,Wu JK,Lee PC,et al.Biologic susceptibility of hepatocellular carcinoma patients treated with radiotherapy to radiation-induced liver disease[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2004,60(5): 1502-1509.

[3] Graf D,Haselow K,Münks I,et al.Inhibition of interferon-alpha-induced signaling by hyperosmolarity and hydrophobic bile acids[J].Biol Chem,2010,391(10):1175-1187.

[4] Cheng JC,Liu HS,Wu JK,et al.Inclusion of biological factors in parallel-architecture normal-tissue complication probability model for radiation-induced liver disease[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,62(4):1150-1156.

[5] Zhang J,Fu LL,Tian M,et al.Design and synthesis of a novel candidate compound NTI-007 targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide [NTCP]-APOA1-HBx-Beclin1-mediated autophagic pathway in HBV therapy[J].Bioorg Med Chem,2015,23(5):976-984.

[6] Elinger S.HBV:Stowaway of NTCP[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2014,38(6):661-663.

[7] Dong Z,Ekins S,Polli JE.Structure-activity relationship for FDA approved drugs as inhibitors of the human sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)[J].Mol Pharm,2013,10(3):1008-1019.

[8] Dong Z,Ekins S,Polli JE.Quantitative NTCP pharmacophore and lack of association between DILI and NTCP Inhibition[J].Eur J Pharm Sci,2014(66C):1-9.

[9] Claro da Silva T,Polli JE,Swaan PW,et al.The solute carrier family 10 (SLC10):beyond bile acid transport[J].Mol Aspects Med,2013,34(2-3):252-269.

[10] Fu LL,Liu J,Chen Y.In silico analysis and experimental validation of azelastine hydrochloride (N4) targeting sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP) in HBV therapy[J].Cell Prolif,2014,47(4):326-335.

[11] 王濤，陳東風(fēng).乙型肝炎病毒受體研究近況與展望[J].肝臟，2013，18(7)：493-495.

[12] Ni Y,Lempp FA,Mehrle S,et al.Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes[J].Gastroenterology,2014,146(4):1070-1083.

[13] Yan H,Peng B,Liu Y,et al.Viral entry of hepatitis B and D viruses and bile salts transportation share common molecular determinants on sodium taurocholate cotransporting polypeptide[J].J Virol,2014,88(6):3273-3284.

[14] Lempp FA,Urban S.Inhibitors of hepatitis B virus attachment and entry[J].Intervirology,2014，57(3-4):151-157.

[15] Schulze A,Schieck A,Ni Y,et al.Fine mapping of pre-S sequence requirements for hepatitis B virus large envelope protein-mediated receptor interaction[J].J Virol,2010,84(4):1989-2000.

[16] Nkongolo S,Ni Y,Lempp FA,et al.Cyclosporin A inhibits hepatitis B and hepatitis D virus entry by cyclophilin-independent interference with the NTCP receptor[J].J Hepatol,2014,60(4):723-731.

[17] Li N,Zhang P,Yang C,et al.Association of genetic variation of sodium taurocholate cotransporting polypeptide with chronic hepatitis B virus infection[J].Genet Test Mol Biomarkers,2014 ,18(6):425-429.

[18] Oehler N,Volz T,Bhadra OD,et al.Binding of hepatitis B virus to its cellular receptor alters the expression profile of genes of bile acid metabolism[J].Hepatology,2014 ,60(5):1483-1493.

[19] Watashi K,Sluder A,Daito T,et al.Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter,sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)[J].Hepatology,2014,59(5):1726-1737.

[20] Phan BA,Dayspring TD,Toth PP.Ezetimibe therapy:mechanism of action and clinical update[J].Vasc Health Risk Manag,2012(8):415-427.

[21] Sainz B Jr,Barretto N,Martin DN,et al.Identification of the Niemann-Pick C1-like 1 cholesterol absorption receptor as a new hepatitis C virus entry factor[J].Nat Med,2012 ,18(2):281-285.

[22] Lucifora J,Esser K,Protzer U.Ezetimibe blocks hepatitis B virus infection after virus uptake into hepatocytes[J].Antiviral Res,2013,97(2):195-197.

[23] Yan H,Peng B,He W, et al.Molecular determinants of hepatitis B and D virus entry restriction in mouse sodium taurocholate cotransporting polypeptide[J].J Virol,2013 ,87(14):7977-7991.

[24] 李強(qiáng)，卓其斌，黃玉仙，等.HBV受體及進(jìn)入抑制劑的研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，31(4)：607-610.

[25] Bouezzedine F,Fardel O,Gripon P.Interleukin 6 inhibits HBV entry through NTCP down regulation[J].Virology,2015(481):34-42.

[26] Watashi K,Urban S,Li W,et al.NTCP and beyond:opening the door to unveil hepatitis B virus entry[J].Int J Mol Sci,2014,15(2):2892-2905.

[27] Neurath AR,Strick N,Li YY.Cells transfected with human interleukin 6 cDNA acquire binding sites for the hepatitis B virus envelope protein[J].J Exp Med,1992 ,176(6):1561-1569.

[28] Heinz D,Peters M,Prange R,et al.Possible role of human interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor in hepatitis B virus infection[J].J Viral Hepat,2001,8(3):186-193.

(編校：王儼儼)

Research advances in inhibitor of hepatitis B virus entry

ZHOU Li-ting, ZHANG Si-xi, MA Wei, ZHANG Yong-kaiΔ

(Department of Pharmacy, First Hospital of Jilin University, Changchun 130000, China)

Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) was identified as an hepatitis B virus (HBV) entry receptor and serving as possible drug targets. This article summarizes our current knowledge on the role of NTCP receptor in three years, including the bottleneck on the therapy of HBV, the meaning of finding NTCP receptor and the expression regulation of NTCP. This study also showed the type, mechanism and research progress on the inhibitors of NTCP receptor. In addition, this studies suggest that the inhibitors of NTCP receptor is able to serve as a therapeutic target and may become one of the new strategy against HBV infection.

Na+-taurocholate cotransporter polypeptide; hepatitis B virus; entry inhibitor; review

周利婷，女，碩士，藥師，研究方向：主要從事藥理學(xué)方向的研究，E-mail：zhou1032@126.com；張永凱，通訊作者，男，本科，主管藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：343383824@qq.com。

R978.7

A

1005-1678(2015)06-0168-03