來氟米特對EAE豚鼠外周血CD28/CTLA-4共刺激分子表達的影響

呂志宇，袁正洲，榮本兵，李作孝

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

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來氟米特對EAE豚鼠外周血CD28/CTLA-4共刺激分子表達的影響

呂志宇，袁正洲，榮本兵，李作孝Δ

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

目的 通過觀察來氟米特對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)豚鼠外周血CD28/CTLA-4共刺激分子表達的影響，探討來氟米特對EAE的防治作用及免疫學機制。方法 將50只成年雌性豚鼠隨機分為5組，每組各10只，分別為正常對照組、EAE對照組、低劑量、治療組、中劑量治療組和高劑量治療組。低、中、高劑量治療組于造模前7 d始按體質(zhì)量分別予來氟米特10、20、40 mg/(kg·d)灌胃，均1次/天，至實驗終止。流式細胞術檢測各組外周血CD4+T細胞膜上CD28、CTLA-4共刺激分子表達情況并記錄豚鼠發(fā)病情況。結(jié)果 高、中劑量治療組較EAE對照組潛伏期延長、進展期縮短、神經(jīng)功能障礙評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以高劑量治療組最明顯 (P<0.05)。EAE對照組較正常對照組發(fā)病高峰期外周血CD4+T細胞膜上CD28分子表達升高(P<0.05)，而CTLA-4表達下降(P<0.05)；高、中劑量治療組較EAE對照組CD28分子表達下調(diào)(P<0.05)，而CTLA-4表達升高(P<0.05)；各治療組間CD28分子的表達以高劑量治療組下調(diào)最顯著(P<0.05)，CTLA-4分子的表達以高劑量治療組上調(diào)顯著(P<0.05)。相關分析顯示EAE對照組、各治療組外周血CD28/CTLA-4比值與神經(jīng)功能障礙評分均呈正比(r=0.85,P=0.002；r=0.77,P=0.000)。結(jié)論 來氟米特可減輕EAE豚鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，且劑量越高效果越好。其作用機制可能是通過下調(diào)外周血CD4+T細胞上CD28分子，上調(diào)CTLA-4分子的表達，使EAE豚鼠免疫失衡重新達到平衡，從而減輕炎性反應，調(diào)節(jié)免疫應答，減輕臨床癥狀。

來氟米特；實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎；多發(fā)性硬化；共刺激分子；CD28；CTLA-4

實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)是由T細胞介導的自身免疫性疾病，是研究人類多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)疾病的理想動物模型[1]。CD28、CTLA-4是CD4+T細胞表面重要的共刺激分子，在T細胞激活始動階段發(fā)揮關鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)EAE及MS發(fā)病機制與CD28、CTLA-4異常表達有關[2]。

來氟米特(leflunomide，LEF)及其衍生物是一類新型、高效的免疫調(diào)節(jié)性藥物，已在類風濕性關節(jié)炎中廣泛使用[3]。本研究通過觀察來氟米特對EAE豚鼠的神經(jīng)功能障礙評分的影響及對EAE豚鼠外周血CD4+T細胞表面CD28、CTLA-4表達的影響，探討LEF治療EAE的效果及免疫機制，為尋求MS新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體質(zhì)量為250～300 g的成年雌性豚鼠50只和健康的SD大鼠10只，均為一級合格動物(來源于瀘州醫(yī)學院實驗動物中心)。

1.2 試劑和儀器 來氟米特(由蘇州長征-欣凱制藥有有限公司提供，規(guī)格:20 mg/片)，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗鼠CD4單克隆抗體，藻紅蛋白(PE)標記的抗鼠CD28、CTLA-4單克隆抗體為美國Ebioscience公司產(chǎn)品。福氏完全佐劑，為sigma公司產(chǎn)品。流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 免疫原合成及EAE模型制作：將SD大鼠處死后，迅速取出脊髓，用勻漿器制成50%的勻漿與等量的弗氏完全佐劑(卡介苗10 mg/mL)混合，用注射器抽打至油包水乳劑，制成粗制髓鞘堿性蛋白(crude myelin basic protein, cMBP)。將其注入豚鼠雙側(cè)后足掌皮下各0.3 mL制作EAE模型。

1.3.2 實驗分組：將50只豚鼠隨機分為5組，每組各10只，正常對照組不經(jīng)免疫誘導，其中4組制作EAE模型，分為EAE對照組及低、中、高劑量治療組 。低、中、高劑量治療組于造模前7d始按體質(zhì)量分別予來氟米特10、20、40 mg/(kg·d)灌胃，EAE對照組和正常對照組均予等量生理鹽水灌胃，均1次/天，至實驗終止。

1.3.3 神經(jīng)功能障礙評分：每天上午10:00觀察各組豚鼠臨床表現(xiàn)，記錄EAE神經(jīng)功能障礙評分。神經(jīng)功能障礙評分標準[4]：0分，無明顯異常；1分，后肢不全癱瘓；2分，后肢完全癱瘓；3分，后肢不全癱瘓且前肢完全癱瘓；4分，四肢完全癱瘓或死亡。

1.3.4 實驗終止：將四肢癱瘓、死亡或連續(xù)3 d癥狀評分無加重時作為發(fā)病的高峰期，在發(fā)病高峰期處死動物；未發(fā)病的動物觀察2個月后處死；正常對照組4周后處死。

1.3.5 外周血CD4+T細胞膜上CD28、CTLA-4分子的檢測：采用流式細胞儀全血直標法檢測。肝素抗凝(25 u/mL)的靜脈血100 μL，分裝于2個檢測管，分別加入20 μL FITC-CD4+20 μL PE-CD28，20 μL FITC -CD4+20 μL PE-CD152?；靹蚝笫覝乇芄夥胖?0 min；加入甲酸溶血素650 μL，室溫避光放置10 min；1500 r/min低溫離心5 min，棄上清；用4 ℃ PBS液2 mL洗滌，1500 r/min低溫離心5 min，棄上清，重復該步驟2次；加入PBS 300 μL及固定劑4%多聚甲醛200 μL，充分混勻，4 ℃暗室保存。上流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 正常對照組豚鼠未見發(fā)病，其它各組有不同程序的發(fā)病，如：精神萎靡、活動減少、毛發(fā)不光滑、體質(zhì)量下降以及攝食減少，注射抗原部位皮膚出現(xiàn)紅腫、破潰以及四肢不同程度的癱瘓、尿便失禁，重者死亡。高、中劑量治療組較EAE對照組潛伏期延長、進展期縮短、神經(jīng)功能障礙評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以高劑量治療組最明顯(P<0.05)。見表1。

表1 各組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評分結(jié)果±s)Tab.

*P<0.05，與EAE對照組比較，compared with EAE control group；△P<0.05，與低劑量治療組比較，compared with low dose treatment group

2.2 5組外周血CD4+T細胞膜上CD28、CTLA-4表達的比較 EAE對照組豚鼠發(fā)病高峰期外周血CD4+T細胞膜上CD28分子表達較正常對照組升高(P<0.05)，而CTLA-4較正常對照組表達下調(diào)(P<0.05)；高、中劑量治療組CD28分子表達較EAE對照組降低(P<0.05)，而CTLA-4表達較EAE對照組升高(P<0.05)；CD28分子的表達以高劑量治療組下調(diào)更顯著(P<0.05)，而CTLA-4分子的表達較低劑量治療組，高、中劑量治療組均上調(diào)更顯著(P<0.05)，而高、中劑量治療組之間差異無統(tǒng)計學意義。見表2，圖1。

表2 各組外周血CD4+T細胞膜上CD28、CTLA-4表達Tab.2 Peripheral blood CD28, CTLA-4 expression in each ±s)

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；△P<0.05，與EAE對照組比較，compared with EAE control group；﹟P<0.05，與低劑量治療組比較，compared with low dose treatment group

圖1 流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞膜上CD28(上圖)、CTLA-4(下圖)的表達情況A,A′.正常對照組；B,B′.EAE對照組；C,C′.低劑量治療組；D,D′.中劑量治療組;E,E′.高劑量治療組Fig.1 Flow cytometry to detect the expression of CD28 (above) and CTLA-4 (below) in the peripheral blood CD4+T cell membraneA.control group, B.EAE control group, C.low dose treatment group, D.middle dose treatment group, E.high dose treatment group

2.3 CD28/CTLA-4比值與神經(jīng)功能障礙評分相關性分析 EAE對照組豚鼠發(fā)病高峰期外周血CD4+T細胞膜上表達的CD28/CTLA-4比值與神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(r=0.85,P=0.002)；各治療組的CD28/CTLA-4比值與神經(jīng)功能障礙評分亦呈正相關(r=0.77,P=0.000)。

3 討論

MS是一種自身免疫性疾病，呈全世界分布，發(fā)病率隨緯度升高而增高，好發(fā)于年輕人，男女比率約為1:1.9，大多數(shù)患者表現(xiàn)為反復發(fā)作的神經(jīng)功能障礙，每次發(fā)作都可能殘留一定的癥狀，導致軀體殘疾，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，目前缺乏有效治療措施且不良反應多[5]。以EAE為模型，探討MS的發(fā)病機制、尋求針對MS有效的治療方案，開發(fā)新的有效的治療藥物已經(jīng)成為世界性研究熱點。LEF是人工合成的異惡唑類藥物，是一類新型的免疫抑制劑，其作用機制涉及多個環(huán)節(jié)。其主要特異、非競爭性地抑制線粒體內(nèi)二氫乳酸脫氫酶(DHODH)活性，從而抑制嘧啶核苷酸的從頭合成途徑[6-7]。目前尚未見其應用于EAE和MS的研究。

CD28分子是目前所知共刺激分子CD28超家族成員中唯一表達在未致敏T細胞上的分子，而CTLA-4只表達在活化的T細胞表面，兩分子具有高度的同源性，其天然配體均為B7分子[8]。在抗原提呈細胞(APC)通過抗原-MHC分子復合物特異性識別、結(jié)合T細胞表面的TCR-CD3分子，并向T細胞傳遞第一活化信號時，B7與表達在靜止T細胞表面的CD28結(jié)合，為T細胞活化提供重要的第二信號，T細胞活化后，CTLA-4分子迅速上調(diào)，競爭性與APC上的B7分子結(jié)合，向活化的T細胞傳導抑制信號，從而避免T細胞的過度激活[9-11]。因此，CD28/CTLA-4是T細胞活化啟動階段發(fā)揮重要作用的一對共刺激分子，若動態(tài)平衡受到破壞則可能誘發(fā)自身免疫性疾病[12-13]。Perrin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，用抗CD28的抗體治療EAE可以阻斷其病情的進展。另有研究顯示，在免疫動物時，同時給予抗CTLA-4抗體可加重EAE病情，且在疾病的恢復期間給予該抗體可導致復發(fā)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，EAE對照組外周血CD4+T細胞膜上CD28分子的表達較正常對照組明顯上調(diào)(P<0.05)，提示EAE對照組外周血T細胞處于“預激活”狀態(tài)，相同強度抗原刺激更容易激活EAE外周血T細胞，發(fā)生免疫應答；而起負性免疫調(diào)控作用的CTLA-4分子在EAE發(fā)病高峰期表達明顯減少(P<0.05)，因此對免疫反應的抑制作用減弱，不能夠在T細胞活化后期適時地終結(jié)T細胞應答。EAE對照組豚鼠經(jīng)免疫后均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，且神經(jīng)功能障礙評分與CD28/CTLA-4比值呈正相關(r=0.85,P=0.002)，提示EAE豚鼠外周血CD4+T細胞膜上共刺激分子CD28/CTLA-4失衡的程度與神經(jīng)功能障礙的程度呈正比。

本研究顯示，LEF能延長EAE豚鼠發(fā)病的潛伏期，縮短病程進展期，降低神經(jīng)功能障礙評分，以高劑量治療組最顯著(P<0.05)。高、中劑量治療組外周血CD4+T細胞膜上CD28分子表達較EAE對照組下調(diào)且有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，低劑量治療組與EAE對照組比較無統(tǒng)計學差異；而CTLA-4的表達，高、中劑量治療組較EAE對照組上調(diào)，以高劑量組最顯著(P<0.05)，低劑量治療組與EAE對照組比較無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果提示，LEF可劑量依賴性下調(diào)EAE豚鼠外周血CD4+T細胞上CD28分子的表達，上調(diào)CTLA-4分子的表達。Pearson直線相關分析顯示：3個治療組EAE豚鼠外周血CD4+T細胞膜上CD28/CTLA-4比值與其神經(jīng)功能障礙評分呈正相關(r=0.77,P=0.000)，表明LEF是通過上調(diào)CD28分子，下調(diào)CTLA-4分子的表達，糾正CD28/CTLA-4的失衡而發(fā)揮防治EAE的作用。

綜上所述，LEF可減輕EAE豚鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，且劑量越高，效果越好。其作用機制是通過下調(diào)外周血CD4+T細胞上CD28分子，上調(diào)CTLA-4分子的表達，使EAE豚鼠免疫失衡重新達到平衡，從而減輕炎性反應，調(diào)節(jié)免疫應答，減輕臨床癥狀。鑒于LEF已廣泛應用于類風性性關節(jié)炎的治療，其對EAE特異的細胞免疫的調(diào)節(jié)作用提示其可能對MS具有良好的作用。

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(編校：譚玲)

Effect of leflunomide on peripheral blood CD28/CTLA-4 costimulatory molecules expression in guinea pig with EAE

LV Zhi-yu, YUAN Zheng-zhou, RONG Ben-bing, LI Zuo-xiaoΔ

(Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo investigate immunological mechanism underlying leflunomide(LEF) against experimental allergic encephalomyelitis (EAE) by studying the effects of LEF on peripheral blood CD28/CTLA-4 costimulatory molecules expression in guinea pig with EAE.Methods50 adult female guinea pigs were randomly divided into normal control group,low dose group,EAE control group,middle dose group,and high dose group, 10 guinea pigs in each group respectively.Low, medium and high dose group were treated with LEF 10 mg/kg·D, 20 mg/kg·D and 40 mg/kg·D orally, 1 times/day, to the termination of the experiment.The expression of CD28, CTLA-4 were detected by flow cytometry, incidence was recorded at the same time.ResultsCompared with EAE control group,high dose and middle dose group incubation period were prolonged, progress period were shorten and neurological dysfunction score decreased(P<0.05).Compared with normal control group, the expression of CD28 of EAE control group increased and the decreased expression of CTLA-4 (P<0.05). High, middle dose treatment group compared with EAE control group CD28 down regulated expression (P<0.05), but the expression of CTLA-4 increased(P<0.05). Among the treatment groups, of CD28 molecules with high dose group decreased significantly(P<0.05), the expression of CTLA-4 molecules with high dose treatment groups upregulated significantly (P<0.05).Correlation analysis showed that the EAE control group, the treatment group the CD28/CTLA-4 ratio in peripheral blood and nerve dysfunction score is proportional (r=0.85,P=0.002;r=0.77,P=0.000).ConclusionLEF can reduce EAE guinea pig neurological symptoms, the better and the higher dose effect.Its mechanism may be through down-regulation of CD28 molecules in peripheral blood, upregulation of the expression of CTLA-4 molecule.so as to reduce the inflammatory response, relieve the clinical symptoms.

leflunomide; experimental allergic encephalomyelitis; multiple sclerosis; costimulatory molecules; CD28; CTLA-4

瀘州醫(yī)學院自然科學科研項目(09012)

呂志宇，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)免疫，E-mail: tiantianxs666@163.com；李作孝，通訊作者，男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：神經(jīng)免疫，E-mail: lzx3235@sina.com。

R556

A

1005-1678(2015)06-0039-04