微器官培養(yǎng)技術(shù)及其在前列腺癌研究中的應(yīng)用

江 明黃月皎程 純. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室（南通 600）;. 南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科; . 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系

·專家述評(píng)·

微器官培養(yǎng)技術(shù)及其在前列腺癌研究中的應(yīng)用

江 明1黃月皎2程 純3
1. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室（南通 226001）;
2. 南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科; 3. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系

前列腺癌（prostate cancer, PCa）居西方國家男性中發(fā)生率的首位，也是第二癌癥致死原因[1]。導(dǎo)致前列腺癌致死的主要臨床原因是前列腺癌容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率占所有前列腺癌患者的80%以上[2, 3]。已有研究表明，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境（microenvironment）的相互作用有關(guān)，骨組織的微環(huán)境富含細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、祖細(xì)胞和造血細(xì)胞等，組成了適合前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的微環(huán)境，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、遷移以及存活[4]。最近5年來的研究已經(jīng)證明，各種基因突變類型的前列腺癌具有一些共同的特征，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的前列腺癌治療藥物也有了空前的發(fā)展。但是，關(guān)于前列腺癌基因突變的分子機(jī)制尚不明確，其相對(duì)應(yīng)的有效治療反應(yīng)還不清楚。由于前列腺癌永生化細(xì)胞系很有限，尚不能很好地代表臨床疾病的多樣性，導(dǎo)致了體外研究模型的不足。由于前列腺癌組織建系困難，導(dǎo)致目前在現(xiàn)有公共細(xì)胞庫中前列腺癌細(xì)胞系較少[5]。近年來陸續(xù)有關(guān)于前列腺癌體外微器官培養(yǎng)（organoid culture）新技術(shù)的報(bào)道，該突破性技術(shù)可應(yīng)用于各種臨床表型的前列腺癌樣本進(jìn)行腫瘤生物學(xué)特征和其與腫瘤微環(huán)境相互作用等研究以及臨床抗癌藥物篩選，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化腫瘤治療[6]。

一、腫瘤微器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展

在過去的30多年中，體外腫瘤模型的研究大多數(shù)是以單層二維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的方式進(jìn)行[7, 8]，很少是在三維模式中生長(zhǎng)和形成組織器官樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，其結(jié)果導(dǎo)致了與原發(fā)腫瘤組織存在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性方面的差異，所以不能夠完全代表原發(fā)腫瘤的特點(diǎn)。微器官培養(yǎng)是在體外將器官和組織碎片擴(kuò)增形成穩(wěn)定的微結(jié)構(gòu)并具有基本功能，而這一過程僅需幾天時(shí)間[9]。在90年代，有報(bào)道關(guān)于一些腫瘤，比如肺和咽喉部腫瘤在體外微器官培養(yǎng)條件的研究[10]；近幾年來相繼有報(bào)道小腸、結(jié)直腸、胰腺、胃以及肝臟等組織在體外微器官培養(yǎng)條件的研究[11-14]。Karthaus等優(yōu)化了人正常前列腺組織基底細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的體外微器官培養(yǎng)條件[15]；使用上述前列腺組織體外培養(yǎng)的特定條件，Gao等成功地建立了新型前列腺癌細(xì)胞株，保留了7種來自不同疾病發(fā)展階段的人前列腺癌細(xì)胞系詳細(xì)的分子表型，其中也包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC），這些新型細(xì)胞株可用于體內(nèi)外的各種藥物試驗(yàn)[16]。Karthaus等研究發(fā)現(xiàn)一種依賴于R-spondin1的微器官培養(yǎng)方法，能夠使人或鼠的前列腺上皮細(xì)胞在體外長(zhǎng)期增殖，因?yàn)榍傲邢倩准?xì)胞和腺上皮細(xì)胞均包含多潛能干細(xì)胞，在體外與大鼠泌尿生殖竇間充質(zhì)（urogenital sinus mesenchyme, UGM）組織重組（tissue recombination）培養(yǎng)模型中，可使前列腺體組織再生和分化并保留完整的生物學(xué)特征，表明微器官培養(yǎng)技術(shù)在前列腺組織再生和前列腺癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程分子機(jī)制的研究中具有較好的應(yīng)用價(jià)值[15]。

二、前列腺癌微器官培養(yǎng)技術(shù)

（一）細(xì)胞來源

應(yīng)用于前列腺癌微器官培養(yǎng)的細(xì)胞來源不局限于已建立的細(xì)胞系，還可以是人和鼠前列腺組織的原代培養(yǎng)細(xì)胞、小鼠移植性前列腺癌細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS）等。美國西奈醫(yī)學(xué)中心應(yīng)用人前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和其對(duì)應(yīng)的RANK基因敲減LNCaPRANKL和LNCaPNeo亞型細(xì)胞等進(jìn)行研究[4, 17]；在Karthaus等成功原代培養(yǎng)人正常前列腺基底細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，Gao等運(yùn)用微器官培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人類公共細(xì)胞庫中包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的7株前列腺癌細(xì)胞系，這些細(xì)胞系包含了SPOP基因突變、PTEN基因丟失、TMPRSS2-ERG基因融合以及包含TP53、PIK3R1、FOXA1基因突變和多種染色質(zhì)修飾改變的去勢(shì)治療無效的前列腺癌細(xì)胞系[16]。對(duì)前列腺癌病人組織樣本原代培養(yǎng)，一般挑選具有特征性臨床表現(xiàn)和預(yù)后的活檢或手術(shù)新鮮樣本。通過切取原發(fā)和小鼠移植的新鮮腫瘤組織，用含有四乙酸二氨基乙烷（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）的胰酶消化，然后收集原代細(xì)胞進(jìn)行下一步的微器官培養(yǎng)[18, 19]。在小鼠前列腺微器官培養(yǎng)中，通常應(yīng)用流式細(xì)胞儀將表達(dá)CD49f的基底細(xì)胞和表達(dá)CD24的腺上皮細(xì)胞進(jìn)行分選；而在培養(yǎng)人前列腺組織時(shí)，常用CD49f標(biāo)記基底細(xì)胞，用CD26或CD29標(biāo)記腺上皮細(xì)胞來進(jìn)行分選[4, 15]。iPS細(xì)胞具有分化潛能，可以分化形成各種細(xì)胞類型，其微器官結(jié)構(gòu)形成的兩個(gè)關(guān)鍵事件：嚴(yán)格的細(xì)胞挑選和保證細(xì)胞體系的一致性[20]。

（二）培養(yǎng)條件

進(jìn)行小鼠前列腺癌微器官培養(yǎng)時(shí)，先將小鼠前列腺上皮組織降解，再混入特定細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)Matrigel，在其中增加常規(guī)的微器官培養(yǎng)介質(zhì)，包含表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、Niggin和R-spondin1 （ENR）等[13]。Niggin為BMP抑制劑，在微器官形成的初期能明顯地增加微器官的數(shù)目，并參與微器官的擴(kuò)增；R-spondin1為Wnt信號(hào)通路抑制劑，在前列腺發(fā)育過程中，主要在泌尿生殖竇中表達(dá)，與前列腺細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[21]；還可加入Alk3/4/5的抑制劑A83-01，可抑制TGF-β信號(hào)通路，防止中斷前列腺細(xì)胞的增殖[22, 23]；通常還加入二氫睪酮（DHT），雖然不是必要的營養(yǎng)物質(zhì)，但能明顯增加微器官形成的效率[15]。根據(jù)Jung等的前期研究結(jié)果，在人前列腺組織微器官培養(yǎng)時(shí)需要在培養(yǎng)基質(zhì)Matrigel中加入各種生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2和10 （FGF2，GF10）及前列腺素E2（PGE2）， 這些生長(zhǎng)因子已經(jīng)證實(shí)有助于前列腺細(xì)胞系的增殖[24, 25]。在小鼠前列腺微器官培養(yǎng)中可加入的介質(zhì)成分，即ENR、A83-01和DHT等[14]；Karthaus等在此基礎(chǔ)上還加入了小腸微器官培養(yǎng)中的必需物質(zhì)：尼克酰胺或稱煙酰胺及p38抑制劑SB202190等[15]。

（三）培養(yǎng)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，前列腺多能干細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞形成微器官的能力有明顯的差別，多能干細(xì)胞相對(duì)于腺上皮細(xì)胞具有明顯的高效率[26]。正常野生型小鼠和人體前列腺提取的多能干細(xì)胞，經(jīng)過約一周的培養(yǎng)，單一的細(xì)胞可形成實(shí)體細(xì)胞團(tuán)簇，在2～3周之內(nèi)，形成顯微鏡下可見的微器官腺體結(jié)構(gòu)，經(jīng)免疫組化、免疫熒光等分析顯示，形成的微器官結(jié)構(gòu)由特異性表達(dá)CK5的基底細(xì)胞和表達(dá)CK8的腺上皮細(xì)胞共同組成[15]， 它們也分別特征性地表達(dá)其他一些基底細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞的免疫標(biāo)記，如p63、PSA、雄激素受體（androgen receptor，AR）等[6, 15]。

三、前列腺癌微器官培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究

（一）基因突變和表達(dá)譜檢測(cè)

由于體外建立前列腺癌細(xì)胞株非常困難，導(dǎo)致缺少具有代表性的前列腺癌細(xì)胞系模型。人類公共細(xì)胞系庫中前列腺癌細(xì)胞系較少，不能代表臨床疾病譜，所以迫切需要建立新的具有臨床表型共性的細(xì)胞系和模型以推動(dòng)這一研究領(lǐng)域的進(jìn)展。正常組織體細(xì)胞的培養(yǎng)在衰老之前僅僅經(jīng)歷數(shù)量有限的生物學(xué)信號(hào)通路，這個(gè)現(xiàn)象被稱之為“海弗利克極限（Hayflick limit）”[27]。使用人工方法永生化細(xì)胞，可以恢復(fù)端粒酶的作用以突破這一限制，并活化p53和RB腫瘤抑制基因等信號(hào)通路[28]。最近，Clevers等發(fā)現(xiàn)在微器官培養(yǎng)體系中，正常人和小鼠的前列腺上皮細(xì)胞能被非永生化地?zé)o限期地培養(yǎng)[15]。這個(gè)體系已經(jīng)被充分用于人轉(zhuǎn)移性前列腺癌的培養(yǎng)，并且已經(jīng)成功建立幾個(gè)新的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能更加完整地代表臨床疾病的表型[16]。

研究證實(shí)，Lgr5是Wnt通路的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑R-spondin的受體，在鼠和人的多種成熟器官中作為干細(xì)胞的標(biāo)記，在R-spondin依賴的微器官培養(yǎng)體系中，那些Lgr5標(biāo)記的干細(xì)胞能夠分化并生長(zhǎng)形成上皮樣結(jié)構(gòu)，仍然保持與原始器官組織基因表達(dá)的一致性[29]。近期發(fā)表的應(yīng)用Matrigel作為培養(yǎng)基質(zhì)和增加培養(yǎng)介質(zhì)來研究良惡性前列腺微器官培養(yǎng)體系，其技術(shù)的關(guān)鍵突破點(diǎn)是該體系的培養(yǎng)介質(zhì)能使良性和惡性的前列腺細(xì)胞無限地繁殖，而不需要人工轉(zhuǎn)化，保持基因組圖譜沒有漂移，具有較高的建系成功率[15]。已建立的前列腺癌細(xì)胞系表達(dá)疾病特異性的基因突變，如ETS異位、SPOP突變、FOXA1突變和CHD1缺失等，其在該體外微器官培養(yǎng)模型體系中得以擴(kuò)增[16]，對(duì)這些細(xì)胞系的持續(xù)培養(yǎng)和收集，可以發(fā)現(xiàn)更多的前列腺癌基因突變。

（二）腫瘤生物學(xué)行為研究

研究表明腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為受到周圍微環(huán)境的強(qiáng)烈影響，尤其是受到支持組織和間質(zhì)（即腫瘤微環(huán)境）的影響。不同類型支持細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用影響正常和惡性細(xì)胞的增值、分化和新陳代謝等一系列生物學(xué)行為特性[30]。不同病人的腫瘤細(xì)胞在相同的原代培養(yǎng)條件下，可出現(xiàn)不同的生長(zhǎng)形態(tài)和形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，具有侵襲性生長(zhǎng)方式的細(xì)胞，通常預(yù)示著該病人不良的預(yù)后[31]。Ranga等報(bào)道了利用上皮來源的腫瘤細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)，可方便地應(yīng)用于分析腫瘤侵襲、遷移和腫瘤血管生成的生物學(xué)特性[32]。已有三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AR通過細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)；AR與整合素α2之間存在正反饋調(diào)節(jié)；前列腺癌細(xì)胞的增殖和存活依賴于p-Akt和p-FAK信號(hào)通路活化[4]。更改腫瘤細(xì)胞Matrigel微器官培養(yǎng)的條件，即改變細(xì)胞外基質(zhì)中的組成部分，可應(yīng)用于研究周圍微環(huán)境的組成成分對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響[33]。三維微血管培養(yǎng)的研究顯示，幾種血管生成抑制劑，如：激酶抑制劑和單克隆抗體等對(duì)其敏感；建立腫瘤細(xì)胞分泌血管生成素的三維培養(yǎng)模型，可使前列腺癌細(xì)胞在缺乏外源性生長(zhǎng)因子的情況下繼續(xù)生長(zhǎng)[34]。

（三）藥物實(shí)驗(yàn)

研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的用于藥物篩選的二維細(xì)胞培養(yǎng)模式被證明在藥物濃度、體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境的相互作用和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床應(yīng)用可靠性等方面存在著許多明顯的缺點(diǎn)[30]。前列腺癌微器官培養(yǎng)技術(shù)可以初步解決這些問題，在一個(gè)富含生物性和相關(guān)物質(zhì)的復(fù)合物的培養(yǎng)系統(tǒng)中，均一地和可擴(kuò)增地培養(yǎng)大量前列腺癌細(xì)胞系，可應(yīng)用于藥物篩選和藥物敏感性等體外藥物相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1. 靶向藥物：傳統(tǒng)應(yīng)用二維細(xì)胞培養(yǎng)體系是由于其相比于體內(nèi)移植瘤模型具有易用性、重復(fù)性、低成本和高效益的優(yōu)勢(shì)。而惡性細(xì)胞與周圍微環(huán)境的相互作用及其氧氣、營養(yǎng)梯度和pH值等的差異，使體外二維細(xì)胞培養(yǎng)體系與腫瘤宿主體內(nèi)的“真實(shí)世界”存在著明顯的對(duì)藥物應(yīng)答敏感性的差異，這些差異對(duì)有效性治療藥物的篩選產(chǎn)生了障礙。微器官培養(yǎng)技術(shù)的成功應(yīng)用，構(gòu)成了包含大量良、惡性前列腺組織微器官培養(yǎng)細(xì)胞信息的“百科全書”，可在體外應(yīng)用于臨床疾病譜藥物的篩選。這本“百科全書”記錄了每一個(gè)微器官培養(yǎng)細(xì)胞詳細(xì)的臨床和分子生物學(xué)特征、疾病的特點(diǎn)、治療的反應(yīng)、突變的位點(diǎn)和基因表達(dá)譜等豐富的基本信息，可建立大數(shù)據(jù)平臺(tái)，提供成本和時(shí)間最佳效益的治療方法并應(yīng)用于新藥的研發(fā)，預(yù)測(cè)這項(xiàng)技術(shù)能夠提供個(gè)性化治療靶點(diǎn)和靶向藥物合成的新思路[5]。

此外，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的體外微器官培養(yǎng)技術(shù)開啟了一個(gè)非常令人興奮的新的腫瘤診治策略評(píng)估渠道，簡(jiǎn)單的抽血取代了有技術(shù)性挑戰(zhàn)的轉(zhuǎn)移位置的活檢，避免了病人的痛苦。關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶中和在原發(fā)性腫瘤組織中的生物學(xué)特性，仍有爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步的研究。最近有研究表明，可間接地培養(yǎng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行乳腺癌靶向治療的篩選，這預(yù)示著循環(huán)腫瘤細(xì)胞微器官技術(shù)也可用于研究相關(guān)晚期實(shí)體器官的惡性腫瘤[30]。前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用也指日可待。

2. 藥物療效：醫(yī)療衛(wèi)生監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求在人類臨床治療試驗(yàn)之前必須進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，各種各樣的腫瘤模型已經(jīng)應(yīng)用于評(píng)估腫瘤藥物和生物治療等的療效，其包括先天免疫缺陷小鼠腫瘤移植瘤模型和基因工程小鼠模型等，這些模型受費(fèi)用、腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間以及有效藥物篩選方式等的明顯限制，并且小鼠的生理學(xué)特性和對(duì)治療的敏感性等也潛在地混淆了對(duì)藥物篩選、效果和毒性的判斷[5]。個(gè)體化腫瘤的基因改變均具備特異性，靶向藥物的目的就是基于個(gè)性化治療的基礎(chǔ)上確定治療目標(biāo)的最大效應(yīng)，而大部分抗腫瘤化學(xué)藥物僅選擇性地對(duì)一部分病人有益。如果體外試驗(yàn)?zāi)苡辛Φ刈C明某種藥物對(duì)某一部分特異性人群有益，且能在全部人群中有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該藥物就能夠被批準(zhǔn)應(yīng)用，對(duì)于個(gè)體病人來說，會(huì)避免無效藥物的過度性治療以及有效藥物的缺乏。隨著前列腺癌微器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和優(yōu)化，從活檢標(biāo)本收集足夠的材料，到新一代測(cè)序技術(shù)的普及和提高以及高效的臨床和體外治療試驗(yàn)的進(jìn)行，這些新技術(shù)將是腫瘤診治的重大的科學(xué)進(jìn)步。

然而，目前還不清楚體外微器官培養(yǎng)對(duì)治療的應(yīng)答與其在體內(nèi)應(yīng)答的差異，正在進(jìn)行新建立的癌細(xì)胞系對(duì)治療的應(yīng)答情況的回顧性研究。在微器官培養(yǎng)應(yīng)用于臨床藥物試驗(yàn)之前，還需要大量仔細(xì)的前瞻性驗(yàn)證研究。

四、研究前景及展望

與常規(guī)二維細(xì)胞培養(yǎng)相比，應(yīng)用前列腺癌微器官培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的癌細(xì)胞，其形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、基因DNA狀態(tài)、表達(dá)譜及基因信號(hào)傳導(dǎo)途徑特性等更符合人體腫瘤的實(shí)際生物學(xué)特性。很多腫瘤治療的藥物常常由于無法在動(dòng)物模型或體外研究中獲得準(zhǔn)確的藥物效應(yīng)和毒性反應(yīng)數(shù)據(jù)，而在臨床試驗(yàn)階段即被終止，浪費(fèi)了大量的人力和物力資源。利用先進(jìn)的微器官培養(yǎng)體系進(jìn)行臨床前期藥物的療效和安全性的評(píng)價(jià)和篩選，可大大降低藥物研發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。人前列腺癌微器官培養(yǎng)技術(shù)可應(yīng)用于前列腺癌的發(fā)病機(jī)制、發(fā)生發(fā)展過程和分子機(jī)制以及癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、與腫瘤微環(huán)境的相互作用等腫瘤生物學(xué)行為的研究；通過結(jié)合新一代基因分析等生物信息學(xué)技術(shù)，可篩選合適的靶向藥物或特異性藥物，結(jié)合其對(duì)化療和放療等綜合治療方式的敏感性，以達(dá)到實(shí)現(xiàn)腫瘤個(gè)體化精確治療的目的。

微器官培養(yǎng)是一種新近發(fā)展的應(yīng)用型技術(shù)，其用于前列腺癌的臨床和基礎(chǔ)研究還存在不成熟之處。相對(duì)于體內(nèi)包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的實(shí)際繁雜多變的內(nèi)環(huán)境，體外微器官培養(yǎng)還只能模擬靜態(tài)和短暫的體內(nèi)微環(huán)境，尚不能完全取代二維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型。但微器官培養(yǎng)技術(shù)作為一種新的研究工具，具有二維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)和自身的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有望成為腫瘤體外研究的新標(biāo)準(zhǔn)，在腫瘤臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用前景，綜合應(yīng)用可望最終達(dá)到改善前列腺癌患者預(yù)后、降低病死率和延長(zhǎng)終末生存期的目的。

致謝：本研究課題受國家自然科學(xué)基金（NSFC #81372772）、江蘇特聘教授科研基金[蘇教師（2012）34 號(hào)]和江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目等資助

關(guān)鍵詞器官培養(yǎng)技術(shù); 前列腺腫瘤

參 考 文 獻(xiàn)

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（2015-01-08收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.001

中圖分類號(hào)R 737.25