全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)*

陸金春盧坤剛張紅燁馮瑞祥. 武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院檢驗(yàn)科 （南京 008）;. 南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司; . 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院檢驗(yàn)科

全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)方法的建立及評(píng)價(jià)*

陸金春1**盧坤剛2張紅燁3馮瑞祥1
1. 武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院檢驗(yàn)科 （南京 210028）;
2. 南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司; 3. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院檢驗(yàn)科

摘要目的 建立全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)方法并對(duì)其準(zhǔn)確性、重復(fù)性和線性范圍等進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 利用終點(diǎn)法檢測(cè)精漿鋅濃度，并在全自動(dòng)生化分析儀上建立檢測(cè)參數(shù)，并評(píng)估該方法的試劑空白吸光度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性和線性范圍，同時(shí)與目前臨床上常用的化學(xué)比色法精漿鋅檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較。結(jié)果 試劑空白吸光度平均為0.028。3份高、中、低鋅濃度的精漿樣本重復(fù)測(cè)定10次，其CV值分別為0.67%、2.04%和4.18%。采用回收率分析來評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性，回收率范圍為95.68%～103.81%。精漿鋅濃度在0.2～7 mmol/L范圍時(shí)，具有良好的線性關(guān)系（r2=0.9944）。以精漿鋅檢測(cè)試劑盒（化學(xué)比色法）作為對(duì)照試劑，全自動(dòng)檢測(cè)法作為試驗(yàn)試劑，兩者對(duì)115例精漿樣本的檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異[（2.51±1.26） mmol/L vs （2.54±1.17） mmol/L，t=-1.589，P=0.115]，且呈顯著正相關(guān)（r2=0.9686，P＜0.01）。結(jié)論 本研究建立的全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)法有較低的試劑空白，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較好，且與目前臨床上使用的化學(xué)比色法有很好的一致性。該法操作簡單、快速，精漿樣本無需稀釋，適合臨床上大批量樣本的檢測(cè)篩查，大大節(jié)省了人力和試劑成本。

關(guān)鍵詞鋅/分析; 精液

人精漿中含有豐富的鋅，其濃度大約是血漿的數(shù)十倍甚至上百倍[1]。鋅不僅在正常睪丸發(fā)育中起重要作用，而且在精子發(fā)生和維持精子活動(dòng)率上起作用[2, 3]。鋅缺乏時(shí)，垂體促性腺激素和雄激素水平降低，繼而可導(dǎo)致性腺機(jī)能減退、精子發(fā)生障礙和第二性征發(fā)育不全[3]。精漿中的鋅主要來自前列腺，其被認(rèn)為是評(píng)價(jià)前列腺分泌功能的重要指標(biāo)之一[4, 5]。研究顯示，自身免疫性前列腺炎、慢性前列腺炎、男性生殖道感染、精索靜脈曲張、脊索損傷、吸煙等均可導(dǎo)致精漿鋅降低[5-8]，從而導(dǎo)致精子參數(shù)異常。黏度高的精液樣本精漿鋅亦顯著降低[9]。檢測(cè)精漿鋅可監(jiān)測(cè)生殖道感染和某些藥物或環(huán)境污染物等對(duì)前列腺分泌功能的影響以及相應(yīng)的治療效果[10, 11]。精漿鋅的測(cè)定亦可用于法醫(yī)學(xué)鑒定[12]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的精漿鋅的檢測(cè)方法主要為原子吸收光譜分析法[9, 13]和手工化學(xué)比色法[4, 14]。前者需要特定的儀器，且需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行特殊處理；而后者，隨著實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化檢測(cè)的發(fā)展，在臨床上的使用也受到一定限制。為此，我們通過廣泛閱讀文獻(xiàn)，建立了以化學(xué)比色法為基礎(chǔ)的全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、試劑和儀器

試劑組成包括：R1試劑，主要由[1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚]（PAN）、氯化銨、氨水、氟化銨、十二烷基硫酸鈉（SDS）和甲醇組成；2 mmol/L鋅標(biāo)準(zhǔn)液。PAN、氯化銨和甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氟化銨和硫酸鋅購自西隴化工股份有限公司；SDS購自阿拉丁試劑（中國）有限公司；氨水購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純以上級(jí)別。檢測(cè)儀器為邁瑞B(yǎng)S380全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

二、檢測(cè)原理

鋅與PAN反應(yīng)可生成紅色絡(luò)合物，在540～550 nm波長處有較強(qiáng)的吸收峰，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度和吸光度即可計(jì)算出精漿樣本中的鋅濃度。

三、檢測(cè)方法

精液樣本液化后，3 000×g離心15 min，取上層精漿直接上機(jī)檢測(cè)，儀器自動(dòng)檢測(cè)標(biāo)本并給出結(jié)果?；緟?shù)為：主波長：546 nm；副波長：660 nm；分析方法：終點(diǎn)法；R1試劑：300 μl；樣本量：3 μl；孵育時(shí)間：300 s。

四、試劑空白吸光度

用純化水替代精漿樣本進(jìn)行測(cè)試，記錄測(cè)試啟動(dòng)時(shí)的主波長下的吸光度值（A1）和5 min后的吸光度值（A2），A2即為試劑空白吸光度。試驗(yàn)重復(fù)5次。

五、線性分析

用純化水配制7、6、5、4、3、2、1、0.2 mmol/L的鋅溶液，以此溶液作為標(biāo)本，以2 mmol/L鋅標(biāo)準(zhǔn)液定標(biāo)后，儀器自動(dòng)檢測(cè)并給出結(jié)果。以理論值和實(shí)際檢測(cè)結(jié)果繪制相關(guān)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。

六、重復(fù)性分析

選取高、中、低鋅濃度的精漿樣本3份，分別用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)10次，計(jì)算變異系數(shù)（CV）。

七、回收率分析

選取2份精漿標(biāo)本，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)其鋅含量，然后分別加入一定量的鋅標(biāo)準(zhǔn)液（3.18 mmol和4 mmol），混勻后再次檢測(cè)4份樣本的精漿鋅濃度，計(jì)算各自的回收率。

八、臨床對(duì)照試驗(yàn)

選取液化良好的精液標(biāo)本115份，3 000×g離心15 min獲取上層精漿，精漿標(biāo)本來源于南京軍區(qū)總醫(yī)院生殖遺傳研究室。分別用本研究的全自動(dòng)檢測(cè)法和精漿鋅檢測(cè)試劑盒（天津瑞愛金生物科技有限公司）進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按各自的說明書進(jìn)行。計(jì)算兩者的相關(guān)系數(shù)（r），并進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所測(cè)數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析和配對(duì)t檢驗(yàn)，線性關(guān)系作圖以Excel軟件進(jìn)行，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異或有顯著相關(guān)性。

結(jié) 果

一、試劑空白吸光度

測(cè)試劑5次，其空白吸光度平均為0.0 2 8 （0.026～0.030）。

二、線性分析

結(jié)果顯示：鋅濃度在0.2～7 mmol/L范圍時(shí)，具有良好的線性關(guān)系（r＞0.99），見圖1。

圖1 鋅檢測(cè)的線性分析

三、重復(fù)性分析

3份高、中、低鋅濃度的精漿樣本重復(fù)測(cè)定10次，結(jié)果濃度分別為（5.08±0.034）、（3.09±0.063）和（0.55±0.023） mmol/L；CV值分別為0.67%、2.04%和4.18%，均低于5%。

四、回收率分析

2份精漿樣本所測(cè)鋅濃度分別為1.33和1.28 mmol/L，前者分別加入3.18和4 mmol鋅標(biāo)準(zhǔn)液后，所得鋅濃度分別為4.40和5.10 mmol/L，回收率分別為97.56%和95.68%；后者分別加入3.18和4 mmol鋅標(biāo)準(zhǔn)液后，所得鋅濃度分別為4.63和5.11 mmol/L，回收率分別為103.81%和96.78%。

五、臨床對(duì)照試驗(yàn)

以精漿鋅檢測(cè)試劑盒（化學(xué)比色法）作為對(duì)照試劑，全自動(dòng)檢測(cè)法作為試驗(yàn)試劑，兩者的檢測(cè)結(jié)果分別為（2.51±1.26）mmol/L和（2.54±1.17）mmol/L，兩者比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.589，P=0.11 5）。而且，兩者結(jié)果呈顯著正相關(guān)（r=0.984，P＜0.01），見圖2。

圖2 全自動(dòng)檢測(cè)法和化學(xué)比色法精漿鋅檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析

討 論

精漿中的鋅可穩(wěn)定精子細(xì)胞膜和維持精子染色質(zhì)穩(wěn)定性[15]。精漿中的鋅對(duì)精液凝固和液化亦起作用，射精時(shí)，精液形成凝塊需精液凝固蛋白和鋅的共同作用，鋅結(jié)合凝固蛋白后，可改變凝固蛋白的結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)凝膠形成，隨后，這些結(jié)合鋅的蛋白又可作為前列腺特異抗原（PSA）的底物，進(jìn)而被水解，精液隨之液化[1,16]；精漿中的鋅亦具有抗氧化作用[17]，可清除活性氧；接觸重金屬鉛、鎘、鉻等可導(dǎo)致精子質(zhì)量降低[18]，而補(bǔ)充鋅可拮抗鉛、鎘等的有害效應(yīng)[19]；另外，鋅還有抗陰道毛滴蟲的作用和抗菌作用[20]。

精漿鋅在男性生殖活動(dòng)中起重要作用，研究顯示，不論是補(bǔ)充無機(jī)鋅（硫酸鋅）還是有機(jī)鋅（丙酸鋅），均可明顯改善精子數(shù)、精液量、精子形態(tài)、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、精子DNA完整性、精液液化、體內(nèi)激素狀態(tài)、熱應(yīng)激導(dǎo)致的精子損傷，甚至可用于預(yù)防和治療吸煙引起的不育等[13, 17, 21-25]，精漿中適當(dāng)?shù)匿\濃度是正常精子功能所必需的。但如果精漿中鋅濃度過高，鋅將在精子主段的線粒體中累積[26]，精子存活率和活動(dòng)率將顯著降低[3, 9]，且對(duì)透明帶（ZP）誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)（AR）有不利效應(yīng)[27]。因此，準(zhǔn)確評(píng)估精漿鋅濃度就顯得較為重要了。以往研究檢測(cè)精漿鋅濃度基本為手工分析法和原子吸收光譜分析法，臨床上的應(yīng)用非常有限。基于此，本研究建立了精漿鋅的全自動(dòng)檢測(cè)法，并對(duì)其準(zhǔn)確性和重復(fù)性以及線性關(guān)系等進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

本研究建立的全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)法，試劑空白吸光度平均為0.028，非常低，提示試劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾非常小。將3份高、中、低鋅濃度的精漿樣本重復(fù)測(cè)定10次，CV值分別為0.67%、2.04%和4.18%，均低于5%，滿足了一般生化檢測(cè)的要求。根據(jù)臨床化學(xué)體外診斷試劑盒——中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T26124-2011的要求[28]，采用回收率分析來評(píng)價(jià)準(zhǔn)確性。4份精漿標(biāo)本的回收率范圍為95.68%～103.81%，均在允許范圍之內(nèi)。精漿鋅濃度在0.2～7 mmol/L范圍時(shí)，具有良好的線性關(guān)系（r2=0.9944）。

在對(duì)方法學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，我們亦進(jìn)行了臨床對(duì)照試驗(yàn)。以精漿鋅檢測(cè)試劑盒（化學(xué)比色法）作為對(duì)照試劑，全自動(dòng)檢測(cè)法作為試驗(yàn)試劑，分別檢測(cè)了臨床上的115例精漿樣本，結(jié)果顯示，兩者的檢測(cè)結(jié)果沒有顯著性差異（t=-1.589，P=0.115），且呈顯著正相關(guān)（r2=0.9686，P＜0.01）。提示，本研究建立的全自動(dòng)檢測(cè)法與目前臨床上使用的手工法有很好的一致性。

總之，本研究建立的全自動(dòng)精漿鋅檢測(cè)方法相比于目前的手工法，準(zhǔn)確性和重復(fù)性顯著提高，檢測(cè)過程更為簡單，精漿無需稀釋可直接使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，檢測(cè)速度大為增加，并且可以成批檢測(cè)。需要注意的是，精漿鋅與禁欲時(shí)間呈正相關(guān)[27]，故解釋檢測(cè)結(jié)果時(shí)要考慮禁欲時(shí)間的影響；由于精漿鋅與果糖濃度呈逆相關(guān)，精漿鋅濃度可能受前列腺和精囊腺分泌功能的雙重影響，而精漿總鋅濃度可能是反映前列腺分泌功能和精液質(zhì)量更合適的指標(biāo)；要將質(zhì)量控制體系引入精漿鋅的全自動(dòng)檢測(cè)中，在目前沒有商品化的室內(nèi)和室間質(zhì)控品的情況下，凍融精漿標(biāo)本可以作為鋅測(cè)定的室內(nèi)和室間質(zhì)控品。未來，我們將致力于精漿鋅檢測(cè)的質(zhì)控物和校準(zhǔn)物的研究，以及將此全自動(dòng)檢測(cè)法在臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Jonsson M, Frohm B, Malm J. Binding of semenogelin I to intact human spermatozoa studied by fl ow cytometry and surface plasmon resonance. J Androl 2010; 31(6): 560-565

2 Atig F, Raffa M, Habib BA, et al. Impact of seminal trace element and glutathione levels on semen quality of Tunisian infertile men. BMC Urol 2012; 12: 6

3 Khan MS, Zaman S, Sajjad M, et al. Assessment of the level of trace element zinc in seminal plasma of males and evaluation of its role in male infertility. Int J Appl Basic Med Res 2011; 1(2): 93-96

4 陸金春, 黃宇烽, 張紅燁主編. 現(xiàn)代男科實(shí)驗(yàn)室診斷. 上海: 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2009: 13, 57-65

5 Alexandrino AP, Rodrigues MA, Matsuo T, et al. Evaluation of seminal zinc levels by atomic absorption in men with spinal cord injury. Spinal Cord 2011; 49(3): 435-438

6 Taha EA, Ezz-Aldin AM, Sayed SK, et al. Smoking infl uence on sperm vitality, DNA fragmentation, reactive oxygen species and zinc in oligoasthenoteratozoospermic men with varicocele. Andrologia 2014; 46(6): 687-691

7 Taha EA, Ez-Aldin AM, Sayed SK, et al. Effect of smoking on sperm vitality, DNA integrity, seminal oxidative stress, zinc in fertile men. Urology 2012; 80(4): 822-825

8 Marconi M, Pilatz A, Wagenlehner F, et al. Impact of infection on the secretory capacity of the male accessory glands. Int Braz J Urol 2009; 35(3): 299-308

9 Dissanayake D, Wijesinghe P, Ratnasooriya W, et al. Relationship between seminal plasma zinc and semen quality in a subfertile population. J Hum Reprod Sci 2010; 3(3): 124-128

10 楊險(xiǎn)峰, 郭良慧, 王祖龍, 等. 男性不育癥患者精漿酸性磷酸酶與精漿生化指標(biāo)的相關(guān)性研究. 臨床泌尿外科雜志 2011; 26(9): 694-696

11 Yucra S, Rubio J, Gasco M, et al. Semen quality and reproductive sex hormone levels in Peruvian pesticide sprayers. Int J Occup Environ Health 2006; 12(4): 355-361

12 Hooft PJ, van de Voorde HP. The zinc test as an alternative for acid phosphatase spot tests in the primary identifi cation of seminal traces. Forensic Sci Int 1990; 47(3): 269-275

13 Hadwan MH, Almashhedy LA, Alsalman AR. Oral zinc supplementation restores high molecular weight seminal zinc binding protein to normal value in Iraqi infertile men. BMC Urol 2012; 12: 32

14 王瑞, 鄭濤, 王祖龍, 等. 精液液化異常者精漿中酸性磷酸酶和鋅的檢測(cè)及其臨床意義. 中國男科學(xué)雜志2006; 20(2): 61-62

15 Bj?rndahl L, Kvist U. A model for the importance of zinc in the dynamics of human sperm chromatin stabilization after ejaculation in relation to sperm DNA vulnerability. Syst Biol Reprod Med 2011; 57(1-2): 86-92

16 Yoshida K, Kawano N, Yoshiike M, et al. Physiological roles of semenogelin I and zinc in sperm motility and semen coagulation on ejaculation in humans. Mol Hum Reprod 2008; 14(3): 151-156

17 Abad C, Amengual MJ, Gosálvez J, et al. Effects of oralantioxidant treatment upon the dynamics of human sperm DNA fragmentation and subpopulations of sperm with highly degraded DNA. Andrologia 2013; 45(3): 211-216

18 Mogielnicka-Brzozowska M, Fraser L, Strze?ek J, et al. The antigenic character of zinc-binding proteins and their localization in boar reproductive tract - A preliminary study. Acta Biochim Pol 2013; 60(2): 255-258

19 Rafique M, Khan N, Perveen K, et al. The effects of lead and zinc on the quality of semen of albino rats. J Coll Physicians Surg Pak 2009; 19(8): 510-513

20 Langley JG, Goldsmid JM, Davies N. Venereal trichomoniasis: role of men. Genitourin Med 1987; 63(4): 264-267

21 Azizollahi G, Azizollahi S, Babaei H, et al. Effects of supplement therapy on sperm parameters, protamine content and acrosomal integrity of varicocelectomized subjects. J Assist Reprod Genet 2013; 30(4): 593-599

22 Nematollahi-Mahani SN, Azizollahi GH, Baneshi MR, et al. Effect of folic acid and zinc sulphate on endocrine parameters and seminal antioxidant level after varicocelectomy. Andrologia 2014; 46(3): 240-245

23 Garcia PC, Piffer RC, Gerardin DC, et al. Could zinc prevent reproductive alterations caused by cigarette smoke in male rats? Reprod Fertil Dev 2012; 24(4): 559-567

24 Ghasemi N, Babaei H, Azizallahi S, et al. Effect of long-term administration of zinc after scrotal heating on mice spermatozoa and subsequent offspring quality. Andrologia 2009; 41(4): 222-228

25 Kumar N, Verma RP, Singh LP, et al. Effect of different levels and sources of zinc supplementation on quantitative and qualitative semen attributes and serum testosterone level in crossbred cattle (Bos indicus x Bos taurus) bulls. Reprod Nutr Dev 2006; 46(6): 663-675

26 García-Contreras A, De Loera Y, García-Artiga C, et al. Elevated dietary intake of Zn-methionate is associated with increased sperm DNA fragmentation in the boar. Reprod Toxicol 2011; 31(4): 570-573

27 Liu DY, Sie BS, Liu ML, et al. Relationship between seminal plasma zinc concentration and spermatozoa-zona pellucida binding and the ZP-induced acrosome reaction in subfertile men. Asian J Androl 2009; 11(4): 499-507

28 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T26124-2011——臨床化學(xué)體外診斷試劑（盒）. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2011: 1-7

（2014-10-18收稿）

**通訊作者, E-mail: lujc@androl.cn

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.007

中圖分類號(hào)R321.1

*基金項(xiàng)目資助: 南京市江寧區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012Aa20）

Establishment and evaluation of automatic assay on level of seminal plasma zinc＊

Lu Jinchun1**, Lu Kungang2, Zhang Hongye3, Feng Ruixiang1
1. Department of Laboratory Science, Nanjing Hospital, Jiangsu Corps, the Armed Police Force, PLA, Nanjing 210028, China;
2. Nanjing Xindi Biological Pharmaceutical Engineering Co., Ltd, Nanjing 211112, China;
3. Department of Laboratory Science, Affi liated Nanjing Hospital of Nanjing Medical University / Nanjing First Hospital, Nanjing 210006, China
Corresponding author: Lu Jinchun, E-mail: lujc@androl.cn

AbstractObjective To establish an automatic assay for the level of seminal plasma zinc, and evaluate its accuracy, repeatability and linear range. Methodsthods The concentration of zinc in seminal plasma was analyzed by an automatic biochemical analyzer, and the detection parameters of endpoint method were established. Subsequently, the reagent blank absorbance, accuracy, repeatability and linear range of the automatic method were evaluated, and the results obtained from the method and the seminal plasma zinc detection kit (a colorimetric method) commonly used in clinical laboratories were compared. Resultssults The average absorbance of reagent blank was 0.028. The coeffi cients of variation (CV) for 3 seminal plasma samples with high, middle and low zinc concentration detected for 10 times, respectively, were 0.67%, 2.04% and 4.18%. The accuracy of the automatic method was evaluated by a recovery assay, and the recovery rates ranged from 95.68% to 103.81%. There was a good linear relationship (r2=0.9944) when the seminal plasma zinc concentration ranged from 0.2 to 7 mmol/L. When the the seminal plasma zinc detection kit (a colorimetric method) was as the control, and theautomatic method as the test reagent, there was no any statistical difference ([2.51±1.26] mmol/L vs [2.54±1.17] mmol/L, t=-1.589, P=0.115) but a signifi cant positive correlation (r2=0.9686, P<0.01) between them for the results of 115 seminal plasma samples. Conclusionusion The established automatic method for analysis of seminal plasma zinc concentration has low reagent blank, good repeatability and accuracy, and fi ne concordance with the colorimetric method commonly used in clinical laboratories. The method is simple, rapid, and suitable for screening large numbers of samples, and greatly saves the cost of manpower and reagents, and the seminal plasma samples don’t need to be diluted.

Key wordsords zinc/analysis; semen