利用植物來源鉛結(jié)合蛋白進(jìn)行植物修復(fù)的研究進(jìn)展*

王鳳珠，陳琴芳，俞陸軍，束文圣，肖 仕

(中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州510275)

近年來致力于用轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行土壤中如汞、鎘、砷和硒等重金屬解毒的研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛［1］。這些重金屬都是采礦業(yè)、制造業(yè)等工業(yè)以及農(nóng)業(yè)所產(chǎn)生的環(huán)境污染物，對人類和動物都有很大的毒性，特別是對人類神經(jīng)系統(tǒng)可造成不可逆轉(zhuǎn)的影響并誘發(fā)癌癥［2－3］。同樣，生長在被污染土壤上的植物的生長與發(fā)育也會受到抑制。而重金屬高富集植物和表達(dá)重金屬抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物，能夠耐受這些脅迫同時凈化被污染的環(huán)境［4－5］。植物的根將土壤或者水體中的污染物轉(zhuǎn)運到植物的地上組織如葉和莖中貯存［5］，最后這些含有污染物質(zhì)的植物組織能被收割并進(jìn)行合理處理，這一過程叫做植物修復(fù)［1，5－6］。這種方法特別適用于處理包括砷、鎘和汞等不容易分解的金屬污染物［7］。

將非植物基因在植物中異位表達(dá)的基因工程技術(shù)應(yīng)用于植物修復(fù)已早有報道。例如，表達(dá)能分解三價砷復(fù)合物及解除汞、硒酸鹽毒性的細(xì)菌酶的遺傳轉(zhuǎn)化植物已經(jīng)被報道［1，8］。過表達(dá)酵母液泡轉(zhuǎn)運蛋白YCF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥能更耐受鉛和鎘脅迫，且將這些重金屬富集在地上部分［9］。因此，表達(dá)YCF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥是第一個植物修復(fù)鉛的范例。將該基因在用于植物修復(fù)的植物物種蕓薹Brassica juncea中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株地上部分富集鎘和鉛的量是野生型1.5至2.0倍，這進(jìn)一步證實YCF1在植物修復(fù)中的應(yīng)用潛力［10］。而去除鉛的細(xì)菌P－型ATP酶最終不能將鉛充分富集在植物細(xì)胞中，故被認(rèn)為不適用于植物修復(fù)［9］。由于鉛對人類特別是兒童的健康所帶來的危害不容忽視，因此植物修復(fù)能提供一種有效的策略來消除鉛在食物鏈中的富集和含量［3］。

1 鉛結(jié)合蛋白

有報道指出，人腎組織中的兩個小相對分子質(zhì)量胞質(zhì)蛋白，即相對分子質(zhì)量為5000的胸腺素β－4和9000的?；o酶A結(jié)合蛋白能在活體內(nèi)與生理型的鉛緊密結(jié)合［11］。該研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這兩個在哺乳動物中高度保守的鉛結(jié)合蛋白是暴露于鉛環(huán)境的人體中特異的鉛離子分子靶標(biāo)。這個9000的人類ACBP蛋白與植物、果蠅、酵母和哺乳動物的生物體中高度保守的10000小ACBP蛋白同源［12－13］。ACBP蛋白介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)?；o酶A的轉(zhuǎn)運，通過與已知在脂質(zhì)代謝及其他例如蛋白運輸、小泡運輸和基因調(diào)控等細(xì)胞過程中作為中間調(diào)解者的長鏈?；o酶A酯的結(jié)合而進(jìn)行［12－14］。

相反地，植物中鉛結(jié)合蛋白的鑒定及其在鉛的植物修復(fù)中的潛在應(yīng)用更是鮮有報道。過度表達(dá)鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)運子NtCBP4的轉(zhuǎn)基因煙草能在鉛誘導(dǎo)脅迫下產(chǎn)生超敏反應(yīng)而富集鉛［15］。擬南芥ATP酶結(jié)合匣 (ABC)轉(zhuǎn)運子AtATM3、AtPDR12和At-PDR8的轉(zhuǎn)基因植株雖對鉛具有耐受能力，但由于這些植物缺乏植物修復(fù)過程中在地上部分積累鉛以便最后收獲和處理的前提條件，故被認(rèn)為不適宜應(yīng)用于植物修復(fù)［16－18］。但是后續(xù)研究者將編碼AtATM3的基因在植物修復(fù)常用物種蕓薹Brassica juncea中過表達(dá)，不僅可以提高蕓薹對鎘和鉛的耐受性，而且轉(zhuǎn)基因植株地上部分對于鎘和鉛的富集水平分別是野生型植株的1.5 和2.5 倍［19］。

最近有研究觀察到，編碼乙烯信號途徑的擬南芥EIN2基因的表達(dá)受鉛處理的誘導(dǎo)［20］，ein2突變體比野生型更耐受鉛脅迫且同時富集鉛［21］。而內(nèi)源水楊酸SA的含量也與擬南芥對鉛和鎘的耐受性相關(guān)，比如SA積累突變體snc1的生長被鉛和鎘抑制，而鉛和鎘對SA信號中斷突變體npr1和snc1/nahG植株生長的抑制作用明顯減弱，因此降低植物內(nèi)源SA的含量能減輕擬南芥中鉛和鎘的毒性［22］。更多潛在的跟其他重金屬功能關(guān)聯(lián)的蛋白已經(jīng)從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR中被鑒定出來，其中包括1272個鋅結(jié)合蛋白、108個銅結(jié)合蛋白和4個鎳結(jié)合蛋白［23］。通過搜索同樣的數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)僅有一個潛在蛋白STA1/ATM3可能與鉛有關(guān)［24］。此外，從豆科田青屬Sesbania drummondii中鑒定到一批鉛響應(yīng)基因，其中63個基因在響應(yīng)鉛處理中呈現(xiàn)大于等于2.5倍差異表達(dá)變化［25］。對玉米在鉛處理下的基因組表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)有2379個基因的表達(dá)上調(diào)，1832個基因的表達(dá)下調(diào)，這些基因與翻譯后修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物或者脂質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)［26］。

2 擬南芥?；o酶A結(jié)合蛋白

除相對分子質(zhì)量為10000的 AtACBP6外［27－28］，我們還鑒定到其他5個更大相對分子質(zhì)量的AtACBP蛋白，將擬南芥中的6個ACBP蛋白命名為 AtACBP1 至 AtACBP6［13，29］。這個 AtACBP基因家族編碼的蛋白大小范圍在92個氨基酸 (10400)到668個氨基酸 (73100)，每一個蛋白都含有一個保守的?；o酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域［13，29］。這其中包括已經(jīng)被亞細(xì)胞定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上的膜關(guān)聯(lián)的 AtACBP1 和 AtACBP2［30－31］、細(xì)胞外靶標(biāo)的AtACBP3［32］，還有含有kelch基序的位于胞質(zhì)中的AtACBP4 和 AtACBP5［29，33］。ACBP 蛋白具有明顯不同的亞細(xì)胞定位以及與酰基輔酶A酯不同的親和力［13，27－28，30，32－37］，提示它們在植物脂質(zhì)代謝中有多種多樣的細(xì)胞功能。已經(jīng)被鑒定出來的植物ACBP蛋白總共有4種，包括小ACBP(Class I)，ANK型 ACBP(Class II)，大 ACBP(Class III)，Kelch 型 ACBP(Class IV)［38］。其中，擬南芥 At－ACBP6屬于Class I;AtACBP1和AtACBP2屬于Class II;AtACBP3屬于 Class III;AtACBP4和 At－ACBP5 屬于 Class IV［39］。

AtACBP蛋白中的兩個成員 AtACBP1和 At－ACBP2，有76.9%的氨基酸和N端跨膜結(jié)構(gòu)域是一致的，而且都與膜相關(guān)聯(lián)［30－31，34－35］。此外，其他結(jié)構(gòu)域的存在，如AtACBP1和AtACBP2上的錨蛋白重復(fù)，AtACBP4和AtACBP5上的kelch基序使得它們能夠與蛋白分子伴侶相互作用［36，40－41］。我們最近的結(jié)果進(jìn)一步顯示，重組的AtACBP蛋白可以在體外結(jié)合磷脂PC或者PA，且AtACBP表達(dá)的改變影響磷脂在擬南芥中的分布［28，37，42－43］，這些都暗示著它們在脂質(zhì)代謝中的作用。在AtACBP蛋白家族中，最小的成員AtACBP6在其他真核生物中的同源蛋白已廣為人知［14，27，44］，而其他 5 個成員AtACBP1至AtACBP5在其他生物中的同源蛋白所知甚少。

現(xiàn)已知有幾個AtACBP蛋白家族成員的表達(dá)受非生物和生物脅迫誘導(dǎo)［13］。例如，AtACBP6的表達(dá)受冷凍處理誘導(dǎo)提高［28］，AtACBP4的表達(dá)則為乙烯前體ACC、甲基茉莉酮酸酯和葡萄孢屬念珠菌感染所誘導(dǎo)［41］。通過擬南芥ACBP過表達(dá)植株和基因敲除突變體作為材料進(jìn)行的研究，這些與各種脅迫相關(guān)的AtACBP基因功能均已得到證實［28，36，43］。另外，通過分析 acbp1 和 acbp2 單突變體以及acbp1acbp2雙突變體，我們發(fā)現(xiàn)AtACBP1和AtACBP2蛋白對于早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要［42］。綜上所述，擬南芥ACBP蛋白通過調(diào)節(jié)植物脂質(zhì)和?；o酶A代謝從而在植物發(fā)育和響應(yīng)脅迫中扮演重要的角色。

3 水稻?；o酶A結(jié)合蛋白

研究者對水稻酰基輔酶A結(jié)合蛋白基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生、表達(dá)和功能分析，發(fā)現(xiàn)和雙子葉擬南芥一樣，有6個基因編碼水稻的ACBP蛋白，分別命名為OsACBP1至OsACBP6。它們歸屬的類別有別于上述擬南芥ACBP，OsACBP1、OsACBP2和OsACBP3都屬于Class I;OsACBP4屬于Class II;OsACBP5屬于Class III;OsACBP6屬于Class IV［45］。在煙草表皮細(xì)胞中分別瞬時表達(dá)與綠色熒光蛋白融合的6個OsACBP蛋白來研究它們的細(xì)胞亞定位。和預(yù)期相符的是，OsACBP1和OsACBP2定位在胞質(zhì)，OsACBP4和OsACBP5定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但是 OsACBP3的定位呈現(xiàn)多樣化，而 Os－ACBP6定位在過氧化物酶體。在存在過氧化物酶體脂肪酸氧化缺陷的過氧化物酶體ABC轉(zhuǎn)運子1突變體pxa1中過表達(dá)OsACBP6，可以恢復(fù)IBA過氧化物酶體氧化、創(chuàng)傷誘導(dǎo)的植物生長相關(guān)貯存蛋白VSP1的表達(dá)和茉莉酸JA的積累，這提示Os－ACBP6在過氧化物酶體氧化中起作用，也預(yù)示著水稻ACBP蛋白除了參與脂質(zhì)合成同時也參與了脂質(zhì)降解過程［46］。然而，水稻ACBP蛋白功能的研究還比較有限，其在逆境脅迫特別是重金屬脅迫中的作用是否與擬南芥一致尚未有報道。

4 擬南芥ACBP用于植物修復(fù)的潛力

與人類相對分子質(zhì)量為10000的ACBP結(jié)合鉛［11］的能力相似，我們的研究結(jié)果顯示膜關(guān)聯(lián)的AtACBP重組蛋白rACBP1和rACBP2在體外結(jié)合鉛的能力優(yōu)于重組的10000 ACBP蛋白 rACBP6［47］。與此一致的是，Northern blot結(jié)果顯示鉛處理之后AtACBP1和 AtACBP2的表達(dá)上調(diào)，而AtACBP6的表達(dá)出乎意料地下調(diào)。過表達(dá)AtACBP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗性實驗發(fā)現(xiàn)，AtACBP1過表達(dá)植株比野生型更耐受鉛引發(fā)的脅迫，基因敲除突變體acbp1也表現(xiàn)出對生長培養(yǎng)基中所添加的鉛更敏感的表型［47］。鉛含量測定發(fā)現(xiàn)，AtACBP1過表達(dá)植株在地上部分富集鉛。以上結(jié)果提示AtACBP1可以被用于植物修復(fù)［47］。AtACBP1在植物地上部分富集鉛的能力使其可能有助于移除所污染土壤中的鉛。

我們的實驗結(jié)果進(jìn)一步表明，AtACBP2在質(zhì)膜上與法尼基化重金屬結(jié)合蛋白AtFP6相互作用［36］。翻譯的AtFP6和AtACBP2蛋白在體外都能結(jié)合鉛、鎘、銅，而EDTA則能抑制它們結(jié)合多種多樣的二價金屬離子［36］。AtACBP2和AtFP6的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥在含鎘的生長培養(yǎng)基中對鎘脅迫的耐受性都比野生型更好［36］，這提示著這兩個蛋白很有可能促進(jìn)譬如鉛、鎘和銅重金屬在擬南芥中的轉(zhuǎn)運，因而它們的過表達(dá)植物可能有助于植物修復(fù)這些重金屬。目前仍然需要進(jìn)一步對這些生長在含重金屬培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因植株地上組織進(jìn)行重金屬測定以便評估修復(fù)效用。

5 結(jié)論和展望

我們推測AtACBP1和AtACBP2可能參與質(zhì)膜相關(guān)的將鉛或其他重金屬離子運輸?shù)綌M南芥地上部分的作用，故它們的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物在植物修復(fù)中具有潛在利用價值。由于重組的AtACBP1和At－ACBP2蛋白在體外均能結(jié)合不飽和［14］18:2－CoA和［14］18:3－CoA，因此它們可能在重金屬誘導(dǎo)的脅迫所引發(fā)的質(zhì)膜上的脂質(zhì)雙層膜修復(fù)中發(fā)揮作用［36，47］。擬南芥另外4種ACBP和來自其他植物物種的 ACBP 蛋白在結(jié)合鉛的功能［44，48－50］及其過表達(dá)植株在鉛誘導(dǎo)的脅迫中的耐受性及對重金屬鉛的轉(zhuǎn)運功能目前仍在進(jìn)一步研究中。同時鑒定自其他植物物種例如豆科田青屬毒豆Sesbania drummondii的鉛響應(yīng)基因值得引起關(guān)注［25］。這些基因都為將來從事鉛相關(guān)蛋白應(yīng)用于植物修復(fù)的研究工作提供寶貴的基因資源。

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