沙眼衣原體體外持續(xù)性感染細(xì)胞模型的研究進(jìn)展

白 順 薛耀華 楊 斌 鄭和平

沙眼衣原體體外持續(xù)性感染細(xì)胞模型的研究進(jìn)展

白 順 薛耀華 楊 斌 鄭和平?

沙眼衣原體(Ct)在感染上皮細(xì)胞整個過程中，Ct原體和網(wǎng)狀體兩種形態(tài)交替形成。然而，體外培養(yǎng)過程中，青霉素、IFN－γ、缺鐵等可抑制RB向EB的轉(zhuǎn)化，形成異型RB；當(dāng)誘導(dǎo)因子去除后，網(wǎng)狀體又重新轉(zhuǎn)變?yōu)檎Ｐ螒B(tài)并開始分裂，表現(xiàn)為持續(xù)性感染狀態(tài)。本文對體外Ct持續(xù)性感染細(xì)胞模型的相關(guān)因素以及方法學(xué)的研究進(jìn)展作一綜述。

沙眼衣原體； 持續(xù)性感染； 細(xì)胞模型

泌尿生殖道沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)感染是最常見的性傳播疾病之一。感染后可引起男性尿道炎及女性宮頸炎，但50%的男性和70%的女性Ct感染者不表現(xiàn)出臨床癥狀。1治療不及時可以導(dǎo)致附睪炎、前列腺炎、盆腔炎、異位妊娠等多種并發(fā)癥。2近年來，阿奇霉素治療的失敗和Ct感染病例顯著增加，然而并未發(fā)現(xiàn)Ct臨床分離株耐阿奇霉素的基因突變，3體外藥敏試驗(yàn)也顯示敏感的最小抑菌濃度(MIC)。4細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)在γ－干擾素、青霉素等因素的干擾下，形成異型包涵體(aberrant inclusion body)，Ct可以利用這一機(jī)制逃逸宿主的攻擊，在宿主細(xì)胞內(nèi)保持長期感染，表現(xiàn)為持續(xù)性感染狀態(tài)。本文就沙眼衣原體持續(xù)性感染的細(xì)胞模型研究進(jìn)展作一綜述。

1 持續(xù)性感染的定義

Ct屬于原核細(xì)胞微生物，由于自身不能產(chǎn)生三磷酸腺苷，必須嚴(yán)格寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)，形成類似病毒的獨(dú)特發(fā)育周期。原體(elementary body，EB，直徑約0.2 μm)是成熟的衣原體，具有高度的感染性，但無繁殖能力。通過受體介導(dǎo)的吞飲作用進(jìn)入胞內(nèi)，形成包涵體，在包涵體內(nèi)EB發(fā)育成網(wǎng)狀體(reticulate body，RB，直徑約0.8 μm)、RB無胞壁、無傳染性，代謝活躍，以二分裂方式繁殖并發(fā)育成EB，包涵體隨之逐漸脹大破裂，釋放出EB。正常的發(fā)育周期約需48～72 h。然而γ－干擾素、抗生素以及其他因素可抑制RB向EB的轉(zhuǎn)化，形成脹大的、低電子密度的RB，而包涵體體積變小，即異型包涵體(aberrant inclusion body)。5Ct進(jìn)入異常生活周期，表現(xiàn)為細(xì)菌存活但無感染性的持續(xù)性感染狀態(tài)，當(dāng)去除有關(guān)因素后，又恢復(fù)到感染狀態(tài)。

2 體外Ct持續(xù)性感染的相關(guān)環(huán)境因素

研究證實(shí)γ－干擾素、青霉素、四環(huán)素、喹諾酮類、去鐵甲酰胺、熱休克蛋白、生殖器皰疹病毒2型合并感染等均可以在體外誘導(dǎo)出異型包涵體細(xì)胞模型。5，62.1 抗生素 電子顯微鏡觀察顯示青霉素誘導(dǎo)的RB不能進(jìn)行二分裂增殖，可見變大的畸形RB。當(dāng)青霉素去除后，RB重新轉(zhuǎn)變?yōu)檎Ｐ螒B(tài)并開始分裂，隨后再轉(zhuǎn)化為EB繼續(xù)侵蝕其他細(xì)胞。7轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究結(jié)果顯示，雖然畸形RB沒有分裂，但其一直進(jìn)行DNA復(fù)制和信使RNA合成。5McCoy等發(fā)現(xiàn)青霉素結(jié)合蛋白(PBP－1，PBP－2和PBP－3)與肽聚糖合成相關(guān)，而肽聚糖合成相關(guān)基因如murA等對Ct的生長非常重要。8Skilton等研究青霉素誘導(dǎo)的Ct體外培養(yǎng)持續(xù)性感染模型的生長周期發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)感染衣原體的細(xì)胞在一定濃度的青霉素刺激下能夠繼續(xù)形成異型包涵體，當(dāng)去除青霉素后已經(jīng)異常的RB并不能回到正常的尺寸，但卻能夠在去除10～20 h后重新進(jìn)入正常發(fā)育周期。此外，誘導(dǎo)持續(xù)性感染期間，細(xì)胞的染色體和質(zhì)粒復(fù)制并不受到影響。

除了青霉素外，環(huán)丙沙星、氯霉素、紅霉素、阿奇霉素等一些抗生素具有誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染的作用。9衣原體感染的細(xì)胞后加入氯霉素，開始階段EB轉(zhuǎn)向RB階段受阻，進(jìn)而擾亂RB正常分裂。紅霉素不僅能夠抑制RB轉(zhuǎn)向EB的分化能力，而且還會引起形成比正常RB小2倍的異型RB。紅霉素結(jié)合到核糖體的50S亞基，減少RB核糖體的活性和隨后的蛋白質(zhì)的合成。蛋白質(zhì)合成的減少，可能會導(dǎo)致在膜成分或所需的分化調(diào)節(jié)蛋白的缺乏。Dreses－Werringloer等學(xué)者觀察環(huán)丙沙星和氧氟沙星兩種抗生素作用E型Ct效果的體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗生素可引起異型但有活性的Ct顆粒形式，雖然不能感染細(xì)胞，但培養(yǎng)液中存在具有代謝活性的EB。10

2.2 IFN－γ和氨基酸饑餓 目前IFN－γ在沙眼衣原體持續(xù)性感染模型應(yīng)用中最多。Beatty等研究指出IFN－γ通過誘導(dǎo)IDO建立持續(xù)性感染模型。9IDO是一種促色氨酸降解的酶，而色氨酸是Ct生長中必不可少的氨基酸，因此IFN－γ能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Ct生長停滯現(xiàn)象，且Ct不具有感染性。當(dāng)給予吲哚，Ct可以重新回到正常的生長周期中。此外，這種現(xiàn)象是生殖型(D－K型)Ct所僅有的，因?yàn)樯承虲t的色氨酸合成酶基因trpBA把陰道菌群分泌的吲哚轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼?，促使IFN－γ誘導(dǎo)的Ct不會完全缺乏色氨酸而死亡，建立持續(xù)性感染的狀態(tài)，而其它型Ct的Trp操縱子突變引起色氨酸合成酶失去活性。隨后，Beatty等繼續(xù)發(fā)現(xiàn)IFN－γ誘導(dǎo)感染細(xì)胞后的Ct形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楫愋蚏B，盡管這些RB的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組分缺少M(fèi)OMP蛋白和LPS脂多糖，但是其仍能繼續(xù)合成和分泌免疫破壞性抗原HSP60。HSP60能引起慢性炎癥輸卵管病理改變，進(jìn)而引起盆腔炎、異位妊娠和不孕不育。

Belland等通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析IFN－γ誘導(dǎo)感染HeLa細(xì)胞的D型Ct，結(jié)果顯示在異型包涵體形成過程中，包括DNA修復(fù)和重組、蛋白翻譯等在內(nèi)的許多相關(guān)基因呈明顯上調(diào)趨勢，而蛋白質(zhì)水解、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂、RB到EB轉(zhuǎn)變和EB的DNA濃縮相關(guān)基因卻呈下調(diào)趨勢。11Ct對IFN－γ介導(dǎo)的色氨酸饑餓應(yīng)答反應(yīng)主要包括經(jīng)典的EB－RB－EB生長周期轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答，以及異型包涵體持續(xù)性感染生長狀態(tài)和Ct交替形態(tài)逃避的免疫應(yīng)答等。研究表明，從Ct感染小鼠的脾臟中獲得抑制性T細(xì)胞能夠殺死朗格漢斯細(xì)胞感染的異型包涵體。12

Ct是完全細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌，因此從宿主細(xì)胞中獲取營養(yǎng)物質(zhì)是Ct生長所必需的。當(dāng)?shù)鞍缀铣梢种苿┓啪€菌酮加入至Ct感染的細(xì)胞培養(yǎng)液后，宿主細(xì)胞失去了吸取營養(yǎng)物質(zhì)的能力，Ct變得更大且更容易發(fā)現(xiàn)。早期研究表明，富營養(yǎng)的M199培養(yǎng)液或EMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)的纖維細(xì)胞感染Ct，前者比后者的感染程度更明顯。13Coles等學(xué)者做了L2型Ct感染細(xì)胞在不同氨基酸濃度的EMEM中培養(yǎng)的比較。培養(yǎng)液中氨基酸濃度降至10%時，48 h后Ct包涵體內(nèi)含有大量異型RB，當(dāng)加入半胱氨酸或異亮氨酸后成熟的RB可逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镋B。14

2.3 鐵元素缺乏 所有的原核生物維持正常生理活性時均需要鐵的存在。Ct等細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌也需要鐵才能進(jìn)入哺乳細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制分裂繁衍后代。E型Ct感染HEC－1B細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加鐵螯合化合物，會引起持續(xù)性感染。重新添加轉(zhuǎn)鐵蛋白的培養(yǎng)液后，感染恢復(fù)到正常狀態(tài)，RB重新轉(zhuǎn)到EB。15LaRue等研究發(fā)現(xiàn)缺鐵易引起Ct Hsp60蛋白表達(dá)上升。16隨后Richard等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在Hsp60－1、Hsp60－2和Hsp60－3三個Hsp60蛋白同系物中，能夠引起Ct持續(xù)性感染的是Hsp60－2蛋白。Dill等采用蛋白組學(xué)分析缺鐵誘導(dǎo)的RB蛋白表達(dá)的變化，研究指出RB通過抗氧化損傷的蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)升高適應(yīng)缺鐵的生長環(huán)境。17Thompson和Miller等分別采用DFO和Bpdl建立以誘導(dǎo)缺鐵引起的Ct持續(xù)性感染模型，發(fā)現(xiàn)鐵結(jié)合蛋白YtgA顯著升高，且后者誘導(dǎo)效果要比前者效果更明顯。18，19另有研究指出，生殖道Ct感染是年輕女性的一種常見疾病，月經(jīng)周期中體內(nèi)鐵的濃度變化容易導(dǎo)致Ct持續(xù)性感染向正常感染轉(zhuǎn)變。13

2.4 宿主細(xì)胞分化 單核細(xì)胞感染Ct后，細(xì)胞內(nèi)有大量異型RB；當(dāng)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，正常的RB和EB重新出現(xiàn)。此外，K型Ct在單核細(xì)胞、滑膜組織和正常Hep－2細(xì)胞中培養(yǎng)均有相同結(jié)果。20Ct在正常生長過程中，糖酵解、戊糖酸途徑、三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈、σ因子等11種與生長周期有關(guān)的因子其基因水平均呈上調(diào)趨勢；當(dāng)異型包涵體形成后，除胞質(zhì)分裂外，染色體復(fù)制相關(guān)因子的基因水平均呈下調(diào)趨勢。

Ct感染子宮內(nèi)膜未分化上皮細(xì)胞后能夠形成異型RB，上皮細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移至黏膜表面并分化成正常RB。13另有研究指出，最初的豬腺上皮細(xì)胞感染Ct后可形成異型RB型感染，逐步形成持續(xù)性感染狀態(tài)；而深入分化的豬管腔上皮細(xì)胞則形成正常Ct生長狀態(tài)，管腔細(xì)胞中的Ct不斷生長繁殖對上皮組織造成損傷，并且開始釋放大量的EB。21

此外，MCF－7乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的腺上皮細(xì)胞感染Ct后可形成不同時期的感染形式和異型包涵體。22宿主細(xì)胞分化依賴的完全細(xì)胞內(nèi)寄生細(xì)菌的復(fù)制與宿主沒有區(qū)別。人乳腺癌病毒的繁殖高度依賴由基底細(xì)胞分化的鱗狀上皮細(xì)胞，HPV病毒長期感染基底細(xì)胞容易引發(fā)持續(xù)性感染。

2.5 HSV合并感染 一項(xiàng)研究表明，當(dāng)E型Ct感染

HeLa細(xì)胞24 h后，宿主細(xì)胞再次感染HSV－2型病毒會出現(xiàn)異型RB。23但是，Deka等研究得出Ct和HSV－2共感染HeLa細(xì)胞并不是引起異型包涵體所必須的。Ct感染上皮細(xì)胞后加入紫外線滅活的HSV病毒，能夠誘導(dǎo)Ct持續(xù)性感染。HSP60蛋白表達(dá)升高。感染HSV的細(xì)胞降解后，Ct持續(xù)性感染消除，重新回到正常感染狀態(tài)。6從HSV－2感染子宮頸內(nèi)上皮細(xì)胞和子宮頸圖片的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)來看，體內(nèi)缺乏HSV和Ct共感染的情況下，Ct感染的細(xì)胞有多種途徑與HSV病毒配體結(jié)合。首先，HSV感染產(chǎn)生每空斑形成單位20～200個缺陷的病毒顆粒，有缺陷的病毒顆粒共感染細(xì)胞可能比合并感染有復(fù)制能力的HSV更常見。其次，感染細(xì)胞釋放出的病毒糖蛋白可通過作用衣原體感染的上皮細(xì)胞受體產(chǎn)生持續(xù)性感染。另外，HSV感染的細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)，Ct感染的細(xì)胞和病毒糖蛋白都能相互作用。

3 Ct體外持續(xù)性細(xì)胞模型探討

大多數(shù)文獻(xiàn)報道的Ct體外持續(xù)性模型均采用IFN－γ誘導(dǎo)產(chǎn)生，但在Ct型、感染細(xì)胞、培養(yǎng)液等方向上沒有絕對金標(biāo)準(zhǔn)，因此本文將進(jìn)一步對IFN－γ誘導(dǎo)引起的持續(xù)性模型進(jìn)行深入的探討。

3.1 沙眼衣原體型別 文獻(xiàn)報道表明，不同型的Ct均能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)性感染。Kokab等采用E型Ct感染細(xì)胞，在100 ng/mL的 IFN－γ誘導(dǎo)后能降低56%的包涵體數(shù)量；24Morrison等深入分析IFN－γ誘導(dǎo)不同型Ct之間產(chǎn)生持續(xù)性感染的差異，其結(jié)果顯示在A、B、Ba、G、I和J型Ct中，當(dāng)IFN－γ誘導(dǎo)濃度為0.2 ng/mL時，包涵體數(shù)量降低了99%，敏感性最強(qiáng)。IFN－γ誘導(dǎo)濃度為0.5 ng/mL時，C和F型Ct感染的包涵體EB數(shù)量與對照組相比同樣降低了99%，而D/ L1/L2/L3型Ct的抗IFN－γ干擾能力較其他型更強(qiáng)，需要5 ng/mL以上的IFN－γ才能達(dá)到其他型包涵體的降低程度。25Rodel等研究發(fā)現(xiàn)5 ng/mL IFN－γ作用的D型Ct雖然異型包涵體數(shù)量與對照組相比只下降了20%，但其包涵體內(nèi)的EB幾乎消失，失去了再次感染的能力，這與Kokab的研究結(jié)果非常相似。

3.2 感染細(xì)胞的種類 Ct主要感染上皮細(xì)胞，因此在體外Ct持續(xù)性感染模型的建立中，選擇Hela、Mc-Coy和Hep－2等一些上皮細(xì)胞系最常見，其中最常見的為Hela 229細(xì)胞。McCoy細(xì)胞起源于小鼠成纖維L細(xì)胞，生長力旺盛，營養(yǎng)要求低，具有不受控增殖性，Ct可以感染McCoy細(xì)胞并在其中形成包涵體。此外，近年來的有不少采用Hep－2細(xì)胞做為Ct感染的對象，24許多研究學(xué)者認(rèn)為Hep－2細(xì)胞比Hela 229細(xì)胞更容易受到衣原體的感染。

3.3 培養(yǎng)液的選擇 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液主要采用DMEM、MEM和RPMI1640三大類，一般血清含量為10%，血清類型為FCS或FBS。MEM培養(yǎng)液是現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)中最基礎(chǔ)的，含有最基本的必需氨基酸、維生素、糖類以及無機(jī)離子等成分，可基本滿足一些像McCoy細(xì)胞等營養(yǎng)要求不高的細(xì)胞生長需求。DMEM是高糖培養(yǎng)液，在MEM培養(yǎng)液上添加了幾倍的營養(yǎng)成分，細(xì)胞生長相對較快。而培養(yǎng)液中的生長因子，需要另外添加血清。目前主要采用FCS(小牛血清)和FBS(胎牛血清)兩種血清，含量均占到整個培養(yǎng)液的10%，后者營養(yǎng)成分比前者多，且支原體含量較小。目前Ct感染細(xì)胞培養(yǎng)液相互之間的差別還未有報道，需要進(jìn)一步探討。

4 Ct持續(xù)性感染模型之間的相關(guān)性

已有相關(guān)基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)對沙眼衣原體通過青霉素、IFN－γ和缺鐵等誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的持續(xù)性模型相互比較。26異型包涵體形態(tài)差別不大，且沒有相關(guān)權(quán)威的研究表明不同持續(xù)性模型之間存在基因表達(dá)的差別。2IFN－γ介導(dǎo)的持續(xù)性模型中，MOMP表達(dá)降低，HSP60表達(dá)上升。Nicholson等發(fā)現(xiàn)青霉素作用Ct后，異型RB的ompA/groEL基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒有變化。5相反的，Mathews等發(fā)現(xiàn)IFN－γ誘導(dǎo)的衣原體表達(dá)MOMP蛋白的ompA基因呈上調(diào)趨勢。27此外，Gerard等報道處于對數(shù)期生長的K型Ct，HSP－60－1/groEL基因顯著表達(dá)，而在鐵元素缺乏誘導(dǎo)的異性包涵體中，HSP60－2/CT604基因mRNA和蛋白水平均明顯升高。隨后LaRue等研究用E型Ct也證實(shí)了以上鐵元素誘導(dǎo)的異性包涵體的結(jié)果。因此，當(dāng)前的結(jié)果表明，不同的誘導(dǎo)模型其衣原體轉(zhuǎn)錄應(yīng)答機(jī)制有所不同，當(dāng)然還需要后續(xù)更多的探討研究。

5 結(jié)語

Ct持續(xù)性感染是一個復(fù)雜的免疫調(diào)控反應(yīng)，一般情況下無癥狀，不易于臨床診斷。近年來已有不少相關(guān)耐藥性報道，抗生素治療效果不理想。對于Ct持續(xù)性感染體外細(xì)胞模型的研究，將有助于了解和掌握其具體的感染機(jī)制。同時可通過體外模型的建立，模擬體內(nèi)持續(xù)性感染狀態(tài)，探索臨床診斷和藥物治療的新方法。

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(收稿:2014－06－12 修回:2014－10－16)

Review on cell model persistently infected with Chlamydia trachomatis in vitro

BAI Shun，XU Yao-hua，YANG Bin，et al.Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou，510091

The normal developmental cycle of Chlamydia trachomatis(Ct)is alternated between elementary bodies(EB)and reticulate bodies(RB)in the process of Ct infecting human epithelial cells.However，in vitro，EB become enlarged and developed into the aberrant RB after induced by penicillin，interferon－γ and iron，et al.The aberrant RB returns to normal and cells division continues again after the inducer is removed.This paper aims to summarize the influence factors on cell model persistently infected with Ct in vitro and the development in the model construction.

chlamydia trachomatis；persistence；cell model

廣東省皮膚病醫(yī)院，廣東廣州，510091

?通信作者