分泌性中耳炎動物模型建立方法及研究進(jìn)展

李卓豪　徐果　張志鋼中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（廣州510120）

·綜述·

分泌性中耳炎動物模型建立方法及研究進(jìn)展

李卓豪徐果張志鋼
中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（廣州510120）

分泌性中耳炎（otitis media with effusion，OME）是以中耳積液及聽力下降為主要特征的中耳非化膿性炎性疾病，是耳科的常見病。80%的兒童3歲前曾出現(xiàn)過急性中耳炎的表現(xiàn)，以O(shè)ME為主［1］。然而，一部分患者可以自愈，并且不再復(fù)發(fā)，另外一部分的患者則遷延不愈。OME的病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前學(xué)者普遍認(rèn)為，OME病因有咽鼓管阻塞、感染、變應(yīng)性反應(yīng)，通常涉及多因素，最新的研究表明基因易感性也是一個重要的發(fā)病因素。OME的病因和發(fā)病因素的多樣性決定了臨床診療的復(fù)雜性。因此，建立一種有效的動物模型對于研究OME有較大意義。實(shí)驗(yàn)動物種類多，建立動物模型的方法也很多。本文通過整理各種分泌性中耳炎動物模型，對比其特點(diǎn)，對分泌性中耳炎動物模型動物選擇與建模方法進(jìn)行綜述。

1　實(shí)驗(yàn)動物

目前，常用于實(shí)驗(yàn)的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、栗鼠、兔、貓、犬、獼猴。為了可以進(jìn)行大規(guī)模的動物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用的動物應(yīng)該價格相對便宜，供應(yīng)充足，因此，栗鼠、貓、犬、獼猴并不常用于分泌性中耳炎動物模型。小鼠價格便宜、供應(yīng)充足、可以選擇的品系多，但是由于小鼠體型小，中耳結(jié)構(gòu)太小，不方便觀察與操作［2］。大鼠中耳結(jié)構(gòu)與人類中耳相似，體型較大，但高發(fā)細(xì)菌感染的中耳疾病，且中耳腔容積小，分泌液量少，所以取材困難，對實(shí)驗(yàn)操作要求較高［3］兔具有抵抗力強(qiáng)，聽泡不容易感染的特點(diǎn)，而且中耳腔更大，骨壁厚，聽骨解剖結(jié)構(gòu)與人耳的相似，更具優(yōu)勢［4］，但國內(nèi)外使用兔建立動物模型的研究尚少。國內(nèi)常用豚鼠作為OME的動物模型，但豚鼠抵抗力較差，建模過程容易發(fā)生感染并導(dǎo)致死亡。綜上，建模時應(yīng)根據(jù)具體的研究目的與方法，選用合適的動物。

2　傳統(tǒng)的建模方法

1.改變咽鼓管結(jié)構(gòu)和功能建立動物模型：傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，咽鼓管堵塞是OME的重要甚至唯一的病因。雖然目前的研究發(fā)現(xiàn)OME還有許多其他的發(fā)病原因，但通過改變咽鼓管結(jié)構(gòu)和功能建立OME動物模型的成功率高，效果好，與臨床患者的實(shí)際情況相似。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)動物體型小，建立動物模型時對操作者的技術(shù)要求較高。

2.1機(jī)械阻塞

2.1.1木塞：喬振花等［5］通過頜下徑路用木塞阻塞咽鼓管創(chuàng)建大鼠OME模型，造模成功率為83.3%（20/ 24）。該方法使用了單純物理因素建立了動物模型，可以排除化學(xué)因素的干擾，有助于探究物理因素在OME的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸中的作用。而實(shí)際臨床患者的OME一般為物理、化學(xué)、生物等多種因素導(dǎo)致。

2.1.2膨脹海綿：崔昕燕等［6］經(jīng)軟腭切開使用膨脹海綿阻塞咽鼓管咽口建立可逆性O(shè)ME動物模型，造模成功率為90.9%。該方法的特點(diǎn)是可逆性，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谛g(shù)后14～18 d實(shí)驗(yàn)耳鼓室積液逐漸消失，鼓膜形態(tài)恢復(fù)正常。這個動物模型可以模擬急性O(shè)ME患者發(fā)展與自愈的轉(zhuǎn)歸，造模成功率高。但這種方法無法控制膨脹海綿脫出的時間，可重復(fù)性差。

2.1.3燒灼：常用的燒灼方法有電燒灼、化學(xué)燒灼、微波燒灼等，馬建剛等［7］使用微波探針燒灼豚鼠咽鼓管咽口，實(shí)驗(yàn)組的豚鼠100%出現(xiàn)中耳積液，但該方法容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動物咽喉水腫及術(shù)后進(jìn)食不佳死亡，死亡率達(dá)38%（8/21）。黃秋紅等［8］經(jīng)軟腭切開使用50%三氯乙酸燒灼大鼠咽鼓管咽口，實(shí)驗(yàn)組中大鼠存活并建立動物模型的比例為15/20。使用燒灼方法建立動物模型成功率高，但因?yàn)閯?chuàng)傷較大，造模成功后動物存活率較低。

2.1.4Histoacryl組織膠：Larsson等［9］在蒙古沙鼠聽泡的后下方鉆孔，往咽鼓管鼓室口注射Histoacryl組織膠封堵咽鼓管，造模成功率86.7%（13/15）。Histoacryl組織膠具有組織毒性小，生物相容性高，對局部組織刺激，粘合效果好的優(yōu)點(diǎn)。但這種方法操作難度大，需要練習(xí)組織膠的注射方法，不熟練的操作會導(dǎo)致咽鼓管的封堵失敗。

此外，國外學(xué)者還使用明膠海綿、牙科材料、聚乙烯醇縮醛等堵塞咽鼓管［2，10，11］。

2.1.5功能障礙

Kent等［12］通過臨床觀察三叉神經(jīng)功能紊亂的狗時發(fā)現(xiàn)，三叉神經(jīng)紊亂患側(cè)的耳中有33%出現(xiàn)中耳積液，而對側(cè)耳則沒有中耳積液，提示三叉神經(jīng)功能紊亂導(dǎo)致的咽鼓管功能障礙可以進(jìn)一步導(dǎo)致OME的產(chǎn)生。在過去的報(bào)導(dǎo)中，Schousboe等［13］通過切斷新西蘭兔的腭帆張肌建立了慢性O(shè)ME的動物模型。Alper等［14］使用肉毒毒素麻痹猴腭帆張肌的方法誘導(dǎo)咽鼓管功能障礙成功建立。通過功能障礙建立的動物模型有起病慢，效果不確切的特點(diǎn)，目前已經(jīng)很少采用。但利用其起病慢的特點(diǎn)，可以模仿臨床病人緩慢起病的過程。

對比功能障礙導(dǎo)致的咽鼓管堵塞與機(jī)械堵塞，前者導(dǎo)致的OME發(fā)展慢，病程長，適合建立慢性O(shè)ME的動物模型，而機(jī)械堵塞則適合建立急性O(shè)ME的動物模型。

2　細(xì)菌及產(chǎn)物

OME為非化膿性炎癥，分泌液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性，但隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們從OME的積液中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的DNA和RNA，提示OME與細(xì)菌感染有關(guān)［15］。細(xì)菌及其產(chǎn)物在OME的發(fā)病與發(fā)展中的作用也受到了關(guān)注?？鲁柕龋?6］經(jīng)聽泡穿刺注入50ul肺炎鏈球菌懸液到大鼠左側(cè)中耳腔建立大鼠急性中耳炎動物模型。該方法導(dǎo)致的急性中耳炎多為化膿性中耳炎，僅部分為OME。Morton等［17］使用嗜血桿菌懸液成功建立沙鼠的中耳炎模型，但并未提及中耳炎的類型。因此，未滅活的細(xì)菌懸液并不適合用于建立OME的動物模型

2.1滅活的細(xì)菌懸液

康全清等［18］用滅活的肺炎鏈球菌混懸液0.1ml經(jīng)鼓膜前下方注入鼓室，建模成功率70.8%，中耳積液細(xì)菌培養(yǎng)陰性。滅活的細(xì)菌懸液與未滅活的細(xì)菌懸液相比，優(yōu)勢在于避免了中耳的急性化膿性感染，建立分泌性中耳炎成功率更高。且中耳積液細(xì)菌培養(yǎng)陰性，與臨床患者的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果相同。“post等［19］發(fā)現(xiàn)成人患者中耳積液中肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的陽性率分別為86.7%和33.3%，matar等［20］采用PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)兒童分泌性中耳炎流感嗜血桿菌與肺炎鏈球菌的陽性率分別為94.3%和8.6%。因此，在研究成人分泌性中耳炎與兒童分泌性中耳炎應(yīng)根據(jù)需要選用不同的滅活細(xì)菌懸液。

2.2脂多糖

Dattaray等［21］與Pudrith等［22］成功使用LPS誘導(dǎo)出OME的動物模型，并指出LPS誘導(dǎo)的OME模型具有與臨床上OME患者相似的癥狀。李希平［23］經(jīng)聽泡注入來源于綠膿桿菌的內(nèi)毒素主要提取物—脂多糖建立SD大鼠分泌性中耳炎動物模型，但造模1周后鼓室滲液基本消失，14天時黏膜與纖毛基本恢復(fù)正常。該方法建立的動物模型發(fā)病快，病程短。在此基礎(chǔ)上，付濤等［24］使用聽泡內(nèi)先注入纖維蛋白封閉劑再注入LPS的方法提高單純聽泡內(nèi)注入LPS的方法的成功率，動物模型的病程也隨之延長。這個造模的方法既強(qiáng)調(diào)了感染性因素在OME的核心作用，也注意到咽鼓管堵塞的重要作用。

2.3變應(yīng)反應(yīng)

Hurst［25］認(rèn)為中耳是變應(yīng)反應(yīng)的一個靶位，變應(yīng)反應(yīng)還可以導(dǎo)致咽鼓管通氣功能的障礙，OME的發(fā)病過程中變應(yīng)反應(yīng)起到了重要的作用。

卵清蛋白：國外hardy等［26］及國內(nèi)孫榮等［27］通過腹腔注射卵清白蛋白致敏并經(jīng)鼓膜耳內(nèi)激發(fā)制成大鼠與小鼠動物模型、造模成功率分別為71.4，%（5/7）、75%（12/16）。該方法操作簡單，造模成功率較高。國內(nèi)外尚未見報(bào)導(dǎo)使用兔建立變應(yīng)反應(yīng)相關(guān)的OME動物模型。

2.4炎癥介質(zhì)

血小板活化因子（PAF）：張靜等［28］用血小板活化因子（PAF）經(jīng)鼓膜注入制備豚鼠OME動物模型，造模成功率為89.28%該方法操作簡單，造模成功率高。

國外還有學(xué)者經(jīng)鼓膜注射組胺、血管內(nèi)皮生長因子、腫瘤壞死因子、白三烯D4［29-32］建立OME模型。

3　新型的建模方法

1.基因工程：基因工程技術(shù)的發(fā)展，推動了人們對疾病與基因相關(guān)性的認(rèn)識，但分泌性中耳炎的基因易感性尚不明確，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些基因的改變會導(dǎo)致分泌性中耳炎的發(fā)病率大大升高。

3.1Sh3pxd2b突變

黃秋紅等［33］發(fā)現(xiàn)Sh3pxd2b突變小鼠是一種新型中耳炎小鼠模型，具有中耳明顯滲液的特征，其主要致病因素可能是顱頜面畸形致咽鼓管功能障礙。通過先天畸形導(dǎo)致咽鼓管結(jié)構(gòu)的堵塞，對比人為操作進(jìn)行的堵塞，具有無創(chuàng)傷，無操作誤差影響的優(yōu)點(diǎn)。

3.222q11.2缺失

Fuchs等［34］通過使用Df1/+半合子基因敲除小鼠模擬人類22q11.2缺失的表現(xiàn)，雖然中耳的解剖學(xué)和組織學(xué)分析表明沒有總體結(jié)構(gòu)的異常，但有頻繁的中耳炎跡象，以O(shè)ME為主，包括過度的積液和增厚的黏膜。

3.3Oxgr1敲除

Kerschner等［35］發(fā)現(xiàn)Oxgr1敲除小鼠容易自發(fā)性出現(xiàn)OME，通過耳鏡觀察，高達(dá)82%的Oxgr1敲除小鼠出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)。使用細(xì)菌18s rRNA通用引物進(jìn)行的RT PCR提示中耳并沒有細(xì)菌存在。

3.4Phex突變

Han等［36］的研究顯示Phex突變的小鼠在產(chǎn)后21天，以滲出為特征中耳炎的發(fā)病率為73%。

從基因水平建立動物模型，是一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ难芯糠较?，通過基因突變產(chǎn)生OME。有先天易感性的動物模型，有助于從基因水平闡釋人群對OME易感性及轉(zhuǎn)歸的差異性。有助于研究OME的基因因素與環(huán)境因素間的關(guān)系。

3.5其他

分泌性中耳炎的發(fā)病原因復(fù)雜，除了以上建模的方法，尚有其他關(guān)于OME模型的報(bào)導(dǎo)，用于研究一些特殊類型的OME，如放射性O(shè)ME、氣壓傷性O(shè)ME。

3.5.1放射性損傷：張志鋼等［37］通過單次大劑量的電離輻射建立了新西蘭兔的放射性分泌性中耳炎模型，急性放射性分泌性中耳炎發(fā)生率約為16%。該動物模型有助于研究放射性中耳炎，用于模擬臨床上患者接受頭頸部放療后產(chǎn)生的放射性分泌性中耳炎，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。另外，這個建模方法也選擇了新西蘭兔，為兔的動物模型積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

3.5.2注射硅油：Thornton等［38］直接在栗鼠聽泡內(nèi)注射硅油模擬OME中耳積液。該模型可以運(yùn)用于研究中耳積液對聽力減弱的影響或其他中耳生物力學(xué)方面的研究。但對于OME的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸并不適合。2.3改變氣壓：xu等［39］使用氣壓艙建立大鼠OME模型，在50秒內(nèi)將氣壓艙內(nèi)壓提升到高于周圍大氣壓4kpa并維持10分鐘。通過改變氣壓的方法，可以模擬氣壓傷導(dǎo)致的分泌性中耳炎，但該文獻(xiàn)未提及建模的成功率與死亡率。

4　討論與展望

對于實(shí)驗(yàn)動物的選擇，傳統(tǒng)的建模方法中，因研究人員操作技術(shù)不同、動物培養(yǎng)環(huán)境不同，動物模型的成功率之間缺乏可比性，為了方便進(jìn)行大規(guī)模的動物實(shí)驗(yàn)，考慮經(jīng)費(fèi)、操作難度、造模成功率，比較適合分泌性動物建模的動物有大鼠、豚鼠、兔。兔的動物建模研究尚少，但兔體型較大，中耳結(jié)構(gòu)與人類的相似，中耳腔較大，價格相對便宜，供應(yīng)充足，性格溫順等，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ膭游锬Ｐ?。新型的基因工程建模方法，目前的研究多選用小鼠，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因小鼠相對于其他轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)更成熟，費(fèi)用更低。隨著技術(shù)的發(fā)展，將會有越來越多品種的轉(zhuǎn)基因動物用于動物實(shí)驗(yàn)。

國內(nèi)外有許多建立動物模型的方法，傳統(tǒng)的建模方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究者可以通過自身研究的切入點(diǎn)選擇及改良合適的建模方法。堵塞咽鼓管和破壞咽鼓管功能的方法有利于研究目前中耳炎的熱點(diǎn)——咽鼓管，但因涉及外科手術(shù)的操作，影響動物模型存活率，而且容易出現(xiàn)各種并發(fā)癥，如術(shù)后出血、進(jìn)食不佳，切口感染等。使用細(xì)菌及其產(chǎn)物可用于分泌性中耳炎感染與免疫的研究，但需要注意劑量，劑量過大可導(dǎo)致腦膜炎與敗血癥或者嚴(yán)重的局部反應(yīng)，劑量過小導(dǎo)致建模失敗。變應(yīng)反應(yīng)操作相對簡單，造模成功率較高，但所有經(jīng)鼓膜注射的方法均容易導(dǎo)致鼓膜完整性的破壞，局部反應(yīng)大，容易感染等不良后果。因?yàn)榉置谛灾卸撞∫驈?fù)雜，有學(xué)者提出通過聯(lián)合兩種或以上的方法建立動物模型，提高造模的成功率，延長病程，模擬了多因素導(dǎo)致OME的發(fā)病途徑，是對傳統(tǒng)建模方法的一種創(chuàng)新，也為我們提供建模方法的新思路。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)，為新型建模方法提供了條件。分泌性中耳炎的發(fā)病涉及多因素，而目前的建模方法大多使用某一發(fā)病途徑進(jìn)行OME的誘導(dǎo)模擬，因?yàn)槁?lián)合多種發(fā)病因素的建模方法操作過程繁雜，可重復(fù)性差，實(shí)驗(yàn)誤差大。隨著基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因方面的研究也已經(jīng)成為一種趨勢。通過基因工程建立的動物模型可以大大減少傳統(tǒng)建模方法導(dǎo)致的手術(shù)創(chuàng)傷、局部反應(yīng)等。其可重復(fù)性、可靠性、可控性也大大提高，利用基因易感性建立動物模型，在選擇建立動物模型方法時提供了一種新的思路。但目前對于OME相關(guān)的基因研究還處于起步階段，隨著新技術(shù)的出現(xiàn)和基因研究的深入，可以運(yùn)用于建立動物模型的基因工程技術(shù)也會越來越成熟。另外，對于特殊類型的分泌性中耳炎，也出現(xiàn)對應(yīng)的建模方法。在國內(nèi)外的學(xué)者共同努力下，OME動物模型越來越豐富，為后續(xù)的研究提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

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R764.21

A

1672-2922（2015）04-761-4

2015-10-8審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.04.048

國家自然基金資助項(xiàng)目（81371082）

李卓豪，碩士研究生，研究方向：耳科基礎(chǔ)研究

張志鋼，Email：zhangzz0369@126.com