血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的影響因素及相關(guān)血管疾病

孟立平 郭航遠 季 政

作者單位：325000溫州，溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（孟立平、郭航遠）；浙江大學(xué)紹興醫(yī)院 紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科（郭航遠、季政）

在不同的外界因素影響下，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）具有不同的細胞表型，具有極強的可塑性。正常血管中膜中的VSMCs是一種高分化的細胞，主要起維持血管形態(tài)以及收縮血管的作用，具有低增殖、低遷移、低蛋白分泌的特征；當發(fā)生動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）等血管病變時，VSMCs可以去分化成為未分化的細胞，細胞收縮性能下降，表現(xiàn)出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征[1]。以往把VSMCs細胞表型單純的分為“收縮型”和“分泌型”[2]，現(xiàn)在大量研究已證實，VSMCs可從已經(jīng)分化的“收縮”表型向“分泌”表型方向去分化。在不同的外界因素作用下，VSMCs去分化的程度不同，可表現(xiàn)出各種介于“收縮”型與“分泌”型之間的細胞表型特征，從而在多種血管病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。本文主要闡述近年來有關(guān)VSMCs表型轉(zhuǎn)化影響因素的研究進展以及VSMCs與常見血管疾病之間的關(guān)系。

1 VSMCs不同細胞表型的特征及標志物

分化成熟的“收縮”型VSMCs在機體中主要起維持血管形態(tài)的作用，通過收縮和舒張來調(diào)節(jié)血流量穩(wěn)定，分泌極少量細胞外基質(zhì)，在透射電鏡下肌絲均勻分布，與蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)的核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等細胞器結(jié)構(gòu)相對較少。去分化的“分泌”型VSMCs通過遷移和增殖以及分泌大量細胞外基質(zhì)，在多種血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。在透射電鏡下觀察“分泌”型VSMCs，胞質(zhì)中肌絲明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體明顯增多。

自1979年Chamley等第一次發(fā)現(xiàn)VSMCs具有不同的細胞表型以來，已發(fā)現(xiàn)一大批特異度比較高的可以作為已分化成熟VSMCs標志的蛋白，例如與細胞收縮密切相關(guān)的SMαactin、calponin、SM-MHC、SM22α、smoothelin 等以及參與細胞骨架構(gòu)成的 h-caldesmon、β-vinculin、telokin、metavinculin、desmin等[4]。這些蛋白在分化成熟的VSMCs中表達，其表達量隨著VSMCs的去分化而逐漸減少；相反，最近研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白（osteopontin，OPN）和糖基質(zhì)蛋白在去分化的VSMCs中開始表達，并且表達量與細胞的去分化程度相關(guān)[5]。 通過檢測 SMα-actin、SM-MHC、calponin、OPN 等蛋白的表達情況以及電鏡下觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)特征是近年來國內(nèi)外研究者常用的鑒別VSMCs不同細胞表型的方法[6-7]。VSMCs表型轉(zhuǎn)化是一個連續(xù)過程，迄今尚未發(fā)現(xiàn)單個標志基因能完全確定VSMCs的表型狀態(tài)。因此，綜合應(yīng)用幾個關(guān)鍵的標志指標進行表型鑒定可能會更客觀。

2 VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響因素

機體中VSMCs的表型轉(zhuǎn)化往往受到一系列復(fù)雜的信號分子和環(huán)境因素整合效應(yīng)的影響，現(xiàn)已明確的影響因素主要包括外界的機械力、細胞外環(huán)境中的細胞因子、細胞與細胞之間的相互作用以及細胞內(nèi)部環(huán)境的改變。

2.1 促使VSMCs去分化的因素

血小板源性生長因子B（platelet derived growth factor-B，PDGF-BB）是最早發(fā)現(xiàn)的一種可以促進VSMCs表型轉(zhuǎn)化的因素，它是一種較強的促有絲分裂因子，具有促增殖和遷移的生物活性，又能使VSMCs的合成及分泌功能增強。PDGFBB可以誘導(dǎo)特定DNA的表達或沉默，從而刺激 VSMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖。分化成熟的VSMCs合成和分泌PDGF-BB的能力弱。PDGF-BB主要通過MEK1/ERK和MKK6/p38MAPK兩條途徑發(fā)揮促VSMCs去分化的作用。低劑量的PDGF-BB（20 ng/ml）也是目前離體實驗中制作VSMCs去分化細胞模型的常用藥物[8]。

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）具有誘導(dǎo)VSMCs增殖和遷移的作用，可減少VSMCs中SM-α-actin、SM-22等收縮性蛋白的表達[7]，增加OPN的表達。方立等[7]的實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，AngⅡ（10-6mmol/L）組VSMCs中p38、JNK、ERK、P65 活化增加，原癌基因 c-myc、c-fos表達增加，AngⅡ可能正是通過激活原癌基因c-myc和c-fos，通過p38、JNK、ERK、P65通路而發(fā)揮去分化VSMCs的作用。

除PDGF-BB和AngⅡ以外，bFGF、EGF也是被廣泛認可的具有誘導(dǎo)成熟VSMCs去分化作用的因素。最新研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）作為一種細胞外基質(zhì)降解酶，還可以通過激活蛋白酶活化受體1（protease-activated receptor-1，PAR-1），促進 ERK 磷酸化，最終導(dǎo)致VSMCs收縮型蛋白表達減少，分化成熟的VSMCs向未分化的VSMCs轉(zhuǎn)化[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）具有促進VSMCs增殖和遷移的能力[10]，在此基礎(chǔ)上，我們通過檢測 SM-actin、SM-MCH、calponin、OPN等蛋白的表達量，發(fā)現(xiàn)Hcy組中 SM-MHC和calponin的表達量降低，OPN的表達量升高，進而推測Hcy也具有促進VSMCs去分化的作用，這種作用可能也是Hcy促進VSMCs增殖和遷移的一種重要機制。

2.2 促使VSMCs分化的因素

胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是目前研究最為深入的一種具有抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用的因素。IGF-1主要通過與胰島素樣生長因子受體結(jié)合，激活下游的PI3K-AKT通路，從而增加VSMCs收縮型蛋白的表達，Martin等[11]的實驗結(jié)果顯示，在胰島素樣受體底物被抑制或降解時，IGF-1不能發(fā)揮促進VSMCs分化的作用，同樣的，抑制下游PI3K-AKT通路后IGF-1的作用也被抑制。但值得注意地是，在離體細胞實驗中，培養(yǎng)基中加入IGF-1后，雖然細胞形態(tài)變細長、SM-actin、SM-MHC等收縮性蛋白表達增多這些均與VSMCs分化成熟的特點相符，但IGF-1卻可以增加VSMCs的增殖，與分化成熟的VSMCs特征不符，這也表明VSMCs的分化與去分化是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，在這一過程中可以出現(xiàn)多種細胞表型，而不僅僅是傳統(tǒng)觀點所認為的在“收縮型”和“分泌型”二者之間轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）是目前研究最熱門的具有抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用的因素之一。體內(nèi)外研究均表明，TGF-β對于VSMCs的分化和功能具有重要作用。目前已經(jīng)證實在人、大鼠原代主動脈平滑肌細胞及大鼠主動脈平滑肌細胞系A(chǔ)10中，TGF-β可促進平滑肌標志分子 SMA、SM22α、SM-MHC、calponin的表達，從而發(fā)揮促進或維持平滑肌細胞分化狀態(tài)的作用。TGF-β可以活化 p38、ERK、JNK、PI3K/Akt等信號，其中 PI3K/Akt信號在TGF-β誘導(dǎo)的平滑肌細胞分化中起主要作用。最近一項研究顯示，TGF-β可以抑制由 PDGF-BB引起的 VSMCs中MMP-2的表達，從而減少細胞外基質(zhì)的分泌，維持VSMCs的分化狀態(tài)[12]。與IGF-1相似的是，TGF-β在促進VSMCs分化的同時也會促進 VSMCs增殖[13]，而 Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）可以抑制 TGF-β 的這種作用，促進平滑肌細胞去分化。

雷帕霉素通過與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）結(jié)合，抑制下游S6K1的磷酸化，從而發(fā)揮一系列相關(guān)作用。在Martin等[2]的實驗中，雷帕霉素組VSMCs較Control組磷酸化的S6K1表達減少，SM-MHC、SM-22等收縮性蛋白表達增多；加入雷帕霉素，再通過基因轉(zhuǎn)染的方法增強S6K1的表達，雷帕霉素誘導(dǎo)VSMCs分化成熟的作用則被抑制；如果抑制S6K1的基因表達，VSMCs中收縮性蛋白表達增加，分化增加，以上均表明雷帕霉素通過抑制mTORC/S6K1通路發(fā)揮促進VSMCs分化的作用。

在后續(xù)實驗中，進一步探明了VSMCs去分化的一條信號通路：Rheb法尼基化/mTORC/S6K1/絲氨酸磷酸化/降解胰島素底物受體/抑制PI3K、AKT通路，在這一信號通路傳導(dǎo)過程中，他汀類藥物可以通過抑制部分Rheb法尼基化，從而減弱此信號通路的傳導(dǎo)，最終促進VSMCs的分化成熟，這可能也是他汀除了降脂作用之外發(fā)揮抗AS的另一種機制[6]。

早期實驗發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的VSMCs中SM-actin的表達量增多，細胞分化水平更高。之后Brown等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞向培養(yǎng)液中分泌了某些成分，這些成分通過激活PI3K/AKT通路從而促使VSMCs的分化成熟。Fetalvero等[15]的實驗進一步證實，內(nèi)皮細胞分泌的前列環(huán)素通過與前列環(huán)素受體結(jié)合，激活下游的PKA/cAMP通路，從而發(fā)揮促VSMCs分化成熟的作用。方立等[7]的研究則證實，內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)液也具有促進VSMCs分化成熟的作用，并且強于內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液。他們在后續(xù)實驗中還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞是通過分泌降鈣素基因相關(guān)肽，抑制MAPK通路，減少p38、JNK1/2、ERK1/2這些蛋白的磷酸化，抑制 c-myc、cfos增殖相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮抗AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs去分化作用[16]。

微小 RNAs（microRNAs，miRNAs）是一類進化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，通過降解mRNA或抑制基因翻譯，在翻譯水平調(diào)控基因表達。越來越多的證據(jù)顯示，miRNAs參與了對細胞增殖、遷移和凋亡的調(diào)控[17]。目前已被證實的與VSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)的miRNAs主要包括：miR-221、miR-222、miR-21、miR-146a、miR-133、miR-143 和 miR-145[8]。在大鼠的VSMCs離體實驗中，miR-143和miR-145表達量較高，在細胞中加入PDGF-BB后，這兩種miRNA表達量驟減。但通過基因敲除的手段敲除小鼠miR-143或miR-145基因后，小鼠的VSMCs中SM-actin等收縮性蛋白表達并未明顯減少[18]，表明 miR-143和 miR-145在正常的VSMCs分化過程中并未發(fā)揮作用。但用球囊損傷血管后，miR-143和miR-145基因敲除的小鼠VSMCs分化受阻，表明這些miRNAs主要在血管損傷后的修復(fù)過程中發(fā)揮作用。Cheng等[19]的實驗進一步證實，過表達miR-145的小鼠通過抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF5，從而減少球囊損傷后VSMCs的增殖和遷移。最近Zhao等[20]的研究從細胞和動物兩個層面證實，miR-145通過抑制TGF-βⅡ受體，減少TGF-β誘導(dǎo)的細胞外基質(zhì)分泌，從而促進VSMCs分化。以miRNAs為切入點來調(diào)控VSMCs的表型轉(zhuǎn)化，從而達到相關(guān)疾病的預(yù)防和治療目的是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的熱門領(lǐng)域。

以上所有影響VSMCs分化與去分化的因素最終都通過細胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)而影響VSMCs中特定基因的轉(zhuǎn)錄和表達。表觀遺傳在VSMCs的表型轉(zhuǎn)化中起了決定性的作用。表觀遺傳調(diào)控通過對細胞染色體中結(jié)構(gòu)的修飾，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，最終導(dǎo)致特定基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的表達或沉默[1]，導(dǎo)致VSMCs表現(xiàn)出具有不同特征的細胞表型。

3 VSMCs表型轉(zhuǎn)化與相關(guān)血管疾病

VSMCs的表型轉(zhuǎn)化參與了血管重構(gòu)等病理過程。目前已證實，VSMCs的表型轉(zhuǎn)化在AS和高血壓等疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，同時還參與了某些癌癥、膀胱梗阻性疾病、消化系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)疾病的進程[3，5]。AS是第一個被發(fā)現(xiàn)的與VSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)的疾病，也是目前有關(guān)VSMCs表型轉(zhuǎn)化與疾病之間關(guān)系研究最為深入的一個疾病。而動脈瘤是最近才剛發(fā)現(xiàn)的有VSMCs表型轉(zhuǎn)化參與的血管疾病。

3.1 VSMCs表型轉(zhuǎn)化與AS的關(guān)系

過去大量實驗研究表明，從人體動脈硬化大斑塊下方提取的VSMCs與正常血管VSMCs相比，SM-actin、SM-MHC等收縮性蛋白表達減少，Wagner等[6]的實驗進一步證實了粥樣硬化斑塊中mTORC1活性提高，磷酸化S6K1表達增加。Sartore等[21]通過將豬的股動脈浸泡在血清中，用球囊擴張血管來制作血管損傷和新生血管的體外模型，發(fā)現(xiàn)與無球囊損傷的對照組比較，損傷組中VSMCs中SM-actin等收縮型蛋白減少，OPN等未分化表型的標志蛋白表達增多，mTORC1活性增加，磷酸化S6K1表達增多，表明VSMCs的表型轉(zhuǎn)化參與了動脈血管損傷后血管重建的過程。但是有關(guān)粥樣硬化斑塊中發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的VSMCs來源的問題目前還存在較大爭議。傳統(tǒng)觀點認為，粥樣斑塊中的VSMCs是由動脈中膜中的VSMCs遷移而來，但到目前為止尚無明確的直接證據(jù)來證實這一觀點。最近Schwartz等[22]通過對血管斑塊部分超微結(jié)構(gòu)的研究證實，斑塊中具有VSMCs形狀的細胞出現(xiàn)在由動脈中膜向斑塊遷移的過程中，間接支持了斑塊中VSMCs來源于動脈中膜的觀點。不過也有觀點認為，斑塊中發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的VSMCs其實是由骨髓來源的造血干細胞進入斑塊后分化而成，Iwata等[23]通過實驗證實，斑塊中SMα-actin陽性的細胞來源于血液中的造血干細胞，表明在AS形成過程中，并不是所有的VSMCs都來源于血管中膜。但是由于不僅僅只有VSMCs表達SMα-actin，內(nèi)皮細胞、肌成纖維細胞以及活化了的巨噬細胞都可以表達SMαactin，所以上述實驗中發(fā)現(xiàn)的斑塊中的造血干細胞來源的表達SMα-actin的細胞并不能確定一定是VSMCs。限于目前尚未發(fā)現(xiàn)一種VSMCs特異性表達的蛋白可以用來鑒定VSMCs，所以到現(xiàn)在為止我們還是無法完全明確斑塊中發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的VSMCs來源。

3.2 VSMCs表型轉(zhuǎn)化與動脈瘤的關(guān)系

Schwartz等[22]通過結(jié)扎小鼠胸主動脈兩端，將血管兩端搭橋相通，向兩端結(jié)扎的胸主動脈內(nèi)注入蛋白酶或生理鹽水來制作小鼠在體動脈瘤模型和相應(yīng)的對照模型，分別在第1、3、7、14 天后切片觀察動脈輪廓，PCR 檢測 SM-actin、SM-22及MMP-2的表達，免疫組化檢測caspase-3的表達，實驗結(jié)果顯示蛋白酶組在14 d左右出現(xiàn)明顯的動脈瘤，7 d時蛋白酶組比生理鹽水組中SM-actin、SM-22表達量降低，MMP-2表達量升高，兩組之間caspase-3的表達情況無顯著差異。這一實驗結(jié)果證實了VSMCs表型轉(zhuǎn)換與動脈瘤之間的關(guān)系，但遺憾的是，我們并不能從這一實驗結(jié)果推測出VSMCs表型轉(zhuǎn)化與動脈瘤之間的因果關(guān)系。要想證明二者之間的因果關(guān)系，可以借鑒研究VSMCs表型轉(zhuǎn)化與AS之間關(guān)系的方法，采用雷帕霉素或他汀逆轉(zhuǎn)或阻止VSMC表型轉(zhuǎn)化，如果動脈瘤不發(fā)生或減弱了蛋白酶導(dǎo)致的動脈瘤形成，才能證實VSMC表型轉(zhuǎn)化是動脈瘤形成的一個原因。

3.3 VSMCs表型轉(zhuǎn)化與靜脈曲張的關(guān)系

最近的一項研究通過比較健康人和靜脈曲張患者靜脈中 OPN、integrinβ3、SMA、SM-22 等的表達，發(fā)現(xiàn)靜脈曲張組中OPN、integrinβ表達增加，SMA、SM-22表達減少，特別是在新生血管部位，表明靜脈曲張組中未分化的血管平滑肌細胞增多。雖然通過免疫染色的方法發(fā)現(xiàn)在靜脈曲張患者中血管中膜還可以見到SMA陽性細胞，但是在新生血管處SMA陽性細胞大大減少。電鏡下觀察VSMCs超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，靜脈曲張組VSMCs中核膜部分破裂，線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，符合未分化型VSMCs的特點。以上實驗結(jié)果均表明VSMCs表型轉(zhuǎn)化參與了靜脈曲張的病理過程[5]。

4 小結(jié)

VSMCs的分化與去分化是一個受多種因素調(diào)控的復(fù)雜過程，在這一過程中可出現(xiàn)多種細胞表型，不同表型的VSMCs參與了多種血管疾病的病理生理過程。目前VSMCs表型轉(zhuǎn)化領(lǐng)域面臨的問題主要包括：（1）不同 VSMCs表型之間的明確標志物還有待發(fā)現(xiàn)；（2）VSMCs表型轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)分子機制有待進一步闡明。這也是當今VSMCs表型轉(zhuǎn)化研究的熱點和難點。