抗瓜氨酸蛋白抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展

朱林文思

抗瓜氨酸蛋白抗體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展

朱林文思

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見(jiàn)的慢性自身免疫病，主要表現(xiàn)為炎癥和關(guān)節(jié)損傷。RA的早期診治能避免病情加重和關(guān)節(jié)不可逆損傷。1988年首次發(fā)現(xiàn)RA患者體內(nèi)存在抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPA）［1］。2000年國(guó)外學(xué)者成功合成人工抗原環(huán)瓜氨酸肽（CCP），并利用ELISA方法在RA患者體內(nèi)檢測(cè)到抗CCP抗體，此后大量研究結(jié)果顯示抗CCP抗體對(duì)RA具有較高的敏感性和特異性。2010年ACPA被美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）納入RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。ACPA存在于RA臨床發(fā)病之前，并與RA病情的進(jìn)展和預(yù)后明顯相關(guān)。

1　抗瓜氨酸蛋白抗體的生成

瓜氨酸化蛋白是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種形式。在Ca2+濃度＞10-5mol/L的條件下，肽?；彼崦搧啺泵福≒AD）催化蛋白中的精氨酸殘基脫亞氨基，轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釟埢?，這種改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)隨帶正電荷減少，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使原本隱藏于分子內(nèi)的基團(tuán)暴露，被吞噬清除，加速細(xì)胞死亡。此過(guò)程只出現(xiàn)在凋亡或壞死的細(xì)胞內(nèi)，一般并不會(huì)引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)。但當(dāng)清除系統(tǒng)無(wú)效或能力不足時(shí)，PAD酶和瓜氨酸蛋白就引起免疫反應(yīng)。被釋放的PAD酶，主要是PAD2和PAD4酶，其修飾關(guān)節(jié)滑膜組織中的膠原和纖維蛋白原含有的精氨酸蛋白，產(chǎn)生大量的多樣化的瓜氨酸抗原［2］。因此在導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡的炎癥反應(yīng)過(guò)程中，均可檢測(cè)到瓜氨酸蛋白抗原，與是否RA有關(guān)。然而，在正常人體內(nèi)瓜氨酸蛋白質(zhì)的少量存在極少誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ACPA，而在RA患者中則較為常見(jiàn)，此抗體的產(chǎn)生與患者的遺傳背景和環(huán)境因素有明顯關(guān)系。

2　影響抗瓜氨酸蛋白抗體產(chǎn)生的因素

根據(jù)ACPA產(chǎn)生的途徑，T細(xì)胞對(duì)抗原表位的識(shí)別，B細(xì)胞的活化，PADI4酶的活性以及全身免疫反應(yīng)水平等的改變均可以影響抗體的產(chǎn)生。一般認(rèn)為ACPA的產(chǎn)生由遺傳背景和環(huán)境因素兩方面所影響。

2.1遺傳背景 研究證明，HLA-DR4分子提供抗原至CD4+的T細(xì)胞過(guò)程系RA關(guān)節(jié)炎癥啟動(dòng)的主要環(huán)節(jié)，活化的免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如IL-1，IL-6和TNF-α，這些細(xì)胞因子可刺激成纖維細(xì)胞、上皮組織及間質(zhì)細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶而破壞結(jié)締組織，刺激上皮細(xì)胞上調(diào)粘附分子（ICAM-1及VCAM-1）的表達(dá)，促使炎性細(xì)胞侵入關(guān)節(jié)滑膜而發(fā)生免疫反應(yīng)［3］。

HLA-DRB1基因?qū)A遺傳易感影響力約30%［4］，其β鏈存在一段共同序列（QK/RRAA），稱為RA共同表位（SE），是HLA-DRB1抗原結(jié)合槽的主要構(gòu)成序列。自身抗原可能通過(guò)與該抗原結(jié)合槽結(jié)合而被遞呈?？笴CP抗體的產(chǎn)生是受HLA限制性的，瓜氨酸化修飾的酶PADI4的某些SNPs基因型與RA的發(fā)生有關(guān)［5］。Hill等［6］研究證實(shí)肽鏈精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸后增加了與HLA-DRB1 SE的親和力，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞成熟，輔助B細(xì)胞的分化和成熟，產(chǎn)生ACPA。以瓜氨酸化纖維蛋白原免疫DR4.IE轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎，而非瓜氨酸化纖維蛋白原或免疫野生型C57BL/6則不能。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22（PTPN22）是編碼淋巴特異性蛋白酪氨酸磷酸酶（LYP）的基因。LYP在維持細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。研究顯示PTPN22（R620W）與ACPA陽(yáng)性RA相關(guān)［7］。ERBB3是表皮生長(zhǎng)因子（EGF）受體酪氨酸激酶家族成員。ERBB3位于在CD11c+細(xì)胞（單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞），參與抗原遞呈，激活T細(xì)胞的增殖。近期研究顯示，ERBB3基因中rs2271189與RA的發(fā)病有正相關(guān)性［8］。由于各種群存在基因背景差異，不同種族背景ACPA陽(yáng)性人群的基因也有所不同。研究中發(fā)現(xiàn)［5］，日本人染色體lp36上的NT2034367.1區(qū)域的4個(gè)PADl4基因的SNP外顯子SNP（PADl4-89、PADl4-90、PADl4-92、PADl4-104）單倍體型與RA易感性相關(guān)。在日本和韓國(guó)等亞裔的報(bào)道中也證實(shí)上述結(jié)果。但在歐美裔人群卻發(fā)現(xiàn)雖存在SNP多態(tài)性，卻與RA易感性無(wú)關(guān)。漢族人群有報(bào)道SNP（PADl4-89、PADl4-90和PADl4-104）與RA易感性相關(guān)［9］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)中國(guó)人RA滑膜中PADl4 mRNA高水平轉(zhuǎn)錄。但也有研究者認(rèn)為只有2個(gè)SNP（PADl4-89和PADl4-104）與RA易感性相關(guān)［10］。同時(shí)攜帶SE和PABl4-89 G+、PADl4-92 G+和PADl4-104T+中任一個(gè)SNP少見(jiàn)基因型均明顯增加發(fā)生RA的風(fēng)險(xiǎn)性［7］。提示兩者可能存在一定協(xié)同作用。

2.2環(huán)境因素 研究顯示基因和環(huán)境因素相互作用與RA發(fā)病相關(guān)［11］。煙草暴露（TE）是RA眾所周知的主要環(huán)境危險(xiǎn)因素。且開(kāi)始TE年齡及TE年數(shù)與RA有關(guān)，TE年齡越早，TE年數(shù)越長(zhǎng)，患RA的危險(xiǎn)性越大。不僅因TE在整體上危害身體健康，TE還與ACPA的產(chǎn)生相關(guān)。SE、TE和ACPA抗體的關(guān)系是通過(guò)CD4+T細(xì)胞的作用，影響瓜氨酸化蛋白介導(dǎo)的B細(xì)胞，從而影響ACPA的水平［12］。研究顯示，TE僅在帶SE的患者中是危險(xiǎn)因素。TE可能觸發(fā)針對(duì)瓜氨酸蛋白的免疫反應(yīng)，可能是通過(guò)誘導(dǎo)瓜氨酸化支氣管肺泡的受損細(xì)胞［13］。一旦對(duì)瓜氨酸化蛋白的耐受被打破，TE就可通過(guò)T細(xì)胞或B細(xì)胞免疫反應(yīng)識(shí)別其他HLA分子。比較健康TE者和肺炎TE者的支氣管肺泡細(xì)胞可知，TE可以增加肺中PAD表達(dá)，并從而增加瓜氨酸化蛋白質(zhì)［14］。此外TE和牙齦卟啉單胞菌感染等可造成攜帶SE的RA易感者初始炎癥，導(dǎo)致含PADl4的細(xì)胞凋亡或凋亡過(guò)程中鈣離子內(nèi)流，激活PADl4催化細(xì)胞內(nèi)自身抗原瓜氨酸化并外溢，從而打破耐受。

在其他方面，魚中ω-3脂肪酸有助于防止RA的發(fā)生，改善癥狀。潮濕的環(huán)境與RA的發(fā)病有關(guān)，寒冷和潮濕作為一種全身刺激因子，作用于具有某些遺傳特征的免疫系統(tǒng)，使其發(fā)生功能改變，從而促使RA發(fā)病。另外，寒冷和潮濕作為不良的環(huán)境因素，可能誘發(fā)或加劇某些致病因子的作用，通過(guò)自身免疫機(jī)制發(fā)生RA。此外研究顯示，初潮年齡越大，發(fā)病的危險(xiǎn)性越大。目前認(rèn)為，女性激素可能為RA發(fā)病的保護(hù)因素，表現(xiàn)在妊娠期RA病情的緩解及口服避孕藥的婦女RA發(fā)病率較低。初潮年齡晚也可使女性激素處于較低水平而增加RA發(fā)病的危險(xiǎn)性，同理絕經(jīng)的時(shí)間對(duì)RA的發(fā)病無(wú)影響［15］。

3　抗瓜氨酸蛋白抗體種類

2010年，ACPA被美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）/ 歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）納入RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)ACPA的方法主要是通過(guò)不同瓜氨酸表位，將不同種類的瓜氨酸抗原作為底物進(jìn)行檢測(cè)。抗核周因子（APF）抗體是最早發(fā)現(xiàn)的ACPA抗體，早在1964 年首次發(fā)現(xiàn)，特異性為89% ～ 94%，敏感性為50% ～ 80%。1979 年，抗角蛋白抗體（AKA）被首次發(fā)現(xiàn)，在此后的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AKA的靶抗原是角質(zhì)層的絲聚蛋白，此抗體特異性94% ～ 98%，敏感性40% ～ 60%。此外，還有抗聚角微絲蛋白抗體（AFA）和抗瓜氨酸化纖維蛋白原（ACF）抗體等多種抗體。日前，最為廣泛使用的是抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體，而抗瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體和抗病毒瓜氨酸肽（VCP）抗體也較為常見(jiàn)。

3.1抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體 2000年，國(guó)外學(xué)者成功合成人工抗原環(huán)瓜氨酸肽（CCP），并利用ELISA方法在RA患者體內(nèi)檢測(cè)到抗CCP抗體，大量研究結(jié)果顯示抗CCP抗體對(duì)RA具有較高的敏感性和特異性。2002年至今最廣泛使用的ACPA為第二代CCP抗體。研究顯示，CCP2抗體的特異性達(dá)96%，敏感性72%。約50% ～ 70%的早期RA患者抗CCP2抗體陽(yáng)性［16］，且表型非常穩(wěn)定，治療后幾乎無(wú)患者由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性。相對(duì)RF而言，CCP2抗體特異性更高，僅約1%～2%的健康人CCP2抗體陽(yáng)性，僅少數(shù)的相關(guān)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）［17］，混合型結(jié)締組織?。∕CTD），肌炎等可能有抗CCP2抗體陽(yáng)性，這些抗體陽(yáng)性率約10%。而這些患者，通常也表現(xiàn)出類似RA的癥狀，如多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等，或同時(shí)伴發(fā)RA。多數(shù)研究表明CCP3的檢測(cè)針對(duì)多種瓜氨酸表位抗原，在多數(shù)早期RA患者體內(nèi)存在抗CCP3聯(lián)合表位的抗體，其特異性93%，敏感性74%，與CCP2相比無(wú)優(yōu)勢(shì)。但在RF陰性的RA患者中，第3代CCP抗體被認(rèn)為有更好的普適性［18］。

3.2抗突變型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體 波形蛋白是一類存在于細(xì)胞質(zhì)中的中間纖維絲蛋白，包含43個(gè)精氨酸殘基。該蛋白主要由滑膜微環(huán)境分泌，是表達(dá)在滑膜組織中的一類相關(guān)自身抗體［19］?？筂CV抗體比抗CCP抗體能更好地預(yù)測(cè)RA患者關(guān)節(jié)損傷情況。在RA和其他系統(tǒng)風(fēng)濕性疾病的區(qū)分中，抗MCV抗體表現(xiàn)出更好的敏感性和特異性［20］。抗MCV抗體已經(jīng)被證實(shí)是一種更為敏感的ACPA的抗原性靶點(diǎn)，但特異性低于抗CCP2抗體［21］，兩者聯(lián)合檢測(cè)可以將敏感性提升至85%。

3.3抗病毒瓜氨酸肽（VCP）抗體 近年來(lái)，有研究顯示一種新型病毒瓜氨酸肽（VCP）可用于輔助RA的診斷。VCP包括VCP1和VCP2，分別來(lái)自EB病毒編碼的EBNA-1蛋白和EBNA-2蛋白?？筕CP2抗體特異性95%，敏感性61%。抗CCP抗體陰性的RA患者中VCP1陽(yáng)性1%，而VCP2陽(yáng)性4%。反之，在VCP抗體陰性的RA患者中3%為抗CCP抗體陽(yáng)性［22］。由此可見(jiàn)，抗VCP抗體和抗CCP抗體聯(lián)合檢測(cè)有助于ACPA抗體的檢測(cè)。

4　抗瓜氨酸抗體在RA中的作用

大量研究顯示ACPA的出現(xiàn)早于RA臨床發(fā)病，同時(shí)ACPA表位擴(kuò)展和疾病的發(fā)展有關(guān)。在RF或SE陰性而ACPA或抗CCP抗體陽(yáng)性的關(guān)節(jié)痛患者可以預(yù)測(cè)其可能會(huì)發(fā)展為關(guān)節(jié)炎［23］，在這過(guò)程中其血清內(nèi)可測(cè)得的APCA表位和水平均會(huì)有明顯的提升，這顯示瓜氨酸化可能參與ACPA陽(yáng)性RA的發(fā)展。研究顯示，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中ACPA不僅可以誘導(dǎo)還可以惡化關(guān)節(jié)炎。給II型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型注射瓜氨酸化纖維蛋白原單抗可以使其病情加重。但對(duì)照組中，無(wú)關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物則不會(huì)引起關(guān)節(jié)損傷。此外瓜氨酸化II型膠原或瓜氨酸化纖維蛋白原，可以誘導(dǎo)炎癥性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)小鼠模型［24］。

在體外模型中，ACPA相關(guān)的免疫復(fù)合物可以通過(guò)FcγRIIa與人類巨噬細(xì)胞結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤壞死因子的分泌。ACPA陽(yáng)性的RA患者的滑膜炎損傷速度比ACPA陰性的患者更快［25］。在體外，ACPA能通過(guò)經(jīng)典途徑和旁路途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，證明其在病理生理方面參與RA的病程［26］。這些均證實(shí)瓜氨酸化加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)和損傷。雖然具體機(jī)制尚未明確，但目前研究顯示RA發(fā)病由瓜氨酸抗原抗體介導(dǎo)。

目前研究表明，ACPA陽(yáng)性和陰性是兩種有著明顯不同的危險(xiǎn)因素的RA亞群，這兩個(gè)亞群可視為具有不同病理生理基礎(chǔ)的兩個(gè)獨(dú)立的疾病。功能學(xué)研究顯示ACPA陽(yáng)性RA，能產(chǎn)生CCP抗體；在實(shí)驗(yàn)鼠模型中，顯示CCP抗體可以誘導(dǎo)并且促進(jìn)關(guān)節(jié)炎［27］。不同發(fā)病機(jī)制的疾病有可能會(huì)受益于不同的治療策略。由于ACPA可能與ACPA陽(yáng)性RA患者病情發(fā)展密切相關(guān)，目前主要使用抗風(fēng)濕藥物（DMARDs）中，有些藥物的靶點(diǎn)在于降低ACPA的水平。如甲氨蝶呤目前被廣泛用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他炎癥性疾病。甲氨蝶呤可以有效減緩ACPA陽(yáng)性未分化關(guān)節(jié)炎患者轉(zhuǎn)變?yōu)镽A，但對(duì)于ACPA陰性的患者無(wú)效［28］。不僅是甲氨蝶呤療效不同，臨床試驗(yàn)顯示，在難治性RA中，利妥昔單抗在ACPA陽(yáng)性患者中療效比陰性患者更好。

5　小結(jié)

ACPA是繼RF后RA診斷中的最重要標(biāo)志性自身抗體，與RF相比具有更高的敏感性和特異性。ACPA與遺傳因素和環(huán)境因素共同影響有關(guān)，大量研究顯示，ACPA的出現(xiàn)早于RA臨床發(fā)病，其不僅是RA發(fā)病的潛在危險(xiǎn)因子，還加速RA的惡化。因此早期檢測(cè)未分化關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的APCA水平，可以提前干預(yù)，延遲甚至可能阻止RA的出現(xiàn)。目前最常用的檢測(cè)ACPA方法為針對(duì)抗CCP2抗體的檢測(cè)，此外還有針對(duì)CCP3、MCV、VCP抗體等多種方法，雖然后者無(wú)法在敏感性和特異性兩方面優(yōu)于CCP2，但聯(lián)合檢測(cè)將有助于ACPA抗體的檢出率。

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200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院