山竹殼色素通過微波輔助結(jié)合超濾法分離研究

■周孟清 張 璐賈 峰 宴和平 謝申伍 趙銀麗 黃 進(jìn)

（1河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001；2.廣州市正農(nóng)飼料有限公司，廣東廣州 511450；3.云南東恒集團生物飼料公司，云南富源 655500）

飼料添加劑指各種用于強化畜禽飼料效果和有利于配合飼料生產(chǎn)和貯存的一類非營養(yǎng)性微量成分，來源于植物的飼料添加劑種類繁多，通過分離提取可以獲得無毒的植物活性成分。對動物無毒無害且有明顯促生長等有益作用，但還沒有獲得國家飼料添加劑標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可的植物提取物可以被稱為準(zhǔn)飼料添加劑。綠色天然的飼料添加劑級色素在蛋雞生產(chǎn)中是重要的組成部分，它有利于蛋黃著色，蛋黃顏色是禽蛋感官品質(zhì)評定的一個重要指標(biāo)。非綠色天然色素對人體有不同程度的毒性（溫廣宇等，2003)，甚至?xí)?dǎo)致生育力下降、畸胎等。

山竹原名為莽吉柿，其果樹是藤黃科常綠喬木，原產(chǎn)于東南亞地區(qū)，對環(huán)境的要求十分嚴(yán)格，與榴蓮齊名，號稱“果中皇后”。山竹果實含有豐富的山酮素、羥基檸檬酸、微量元素（陳嘉曦等，2007)等成分，羥基檸檬酸（HCA）對抑制脂肪合成、抑制食欲和降低體重有著良好的功效，山酮素則具有止痛抗菌作用（Palakawong等，2013)，抗病毒，抗突變作用，對心血管系統(tǒng)也有很好的保護作用。山竹果皮含有氧雜蒽酮、單寧酸等物質(zhì)，氧雜蒽酮具有氧化（Moongkarndi等,2014)和抗癌作用（馮建光等，2009)。山竹殼色素是一種醇溶性色素，有較強的抗氧化性、抗熱性，具有良好的穩(wěn)定性（胥秀英等，2006)，其與蔗糖、葡萄糖、苯甲酸鈉等常用食品添加劑有非常好的混用性，Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+及檸檬酸、VC 等不影響其穩(wěn)定性,但Cu2+會加深其顏色，還原劑、紫外光、NaHCO3對色素有減色的作用，F(xiàn)e3+對其具有破壞作用（章斌等，2011)。山竹殼是良好的天然食用和飼料用色素提取原料，其天然紅色素不僅安全，還具有一定的營養(yǎng)價值和藥理作用。

山竹殼色素分離提取是開發(fā)成飼料添加劑的重要步驟，傳統(tǒng)的分離方法具有耗時、耗能、提取率低、化學(xué)成分易改變等缺點，而膜分離技術(shù)具有無污染、無相變、能耗低、操作簡單等優(yōu)點（洪宜斌等,2003)，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到各個領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮山竹(鄭州水果批發(fā)市場),無水乙醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司），鹽酸（分析純，洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司）等。電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），JZ 7114號微型植物粉碎機（上海市嘉定糧油檢測儀器廠），101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實驗儀器總廠),20-270目篩(上虞市五四儀器篩具),D8023CTL-K4型微波爐（佛山市順德區(qū)美的微波爐電器制造有限公司）,723N-可見分光光度計（上?？萍加邢薰荆⒊瑸V膜（天津森諾過濾技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗設(shè)計

采用4因素3水平的正交試驗設(shè)計，如表1所示。

表1 試驗因素及水平

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

山竹殼色素經(jīng)超濾提取后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50度蒸發(fā)得到濃縮物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品。配制30%乙醇-0.108%HCl混合液作溶劑，分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g，用上述溶劑溶解標(biāo)準(zhǔn)品并分別轉(zhuǎn)移至5個25 ml容量瓶內(nèi)，搖勻，靜止。以上述溶劑作為參比溶液，在波長為520 nm處測吸光度，重復(fù)以上操作，做平行試驗，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=26.081x+0.005（R2=0.978 1）。

圖1 山竹殼色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4 試驗步驟及操作

新鮮山竹殼→洗凈→放入干燥箱烘干→粉碎→過篩→微波輔助乙醇溶解→粗過濾→濾液進(jìn)行超濾→可見分光光度計測吸光度→各組分吸光度比較。

烘干：山竹10 kg去肉得山竹殼，50℃烘干10 h,測得水分含量為3%。

粉碎：將山竹殼粗破碎后，放入粉碎機內(nèi)粉碎，然后用30、100、200目的分級篩篩分，分別收取篩下物，篩上部分繼續(xù)用粉碎機粉碎，重復(fù)以上操作，將所得的所有篩下物分別放入原料袋內(nèi)保存，并做好標(biāo)記。

溶劑配制：分別配制30%乙醇-0.108%HCl混合液，40%乙醇-0.108%HCl混合液，50%乙醇-0.108%HCl混合液，密封放置。

溶解：根據(jù)1∶10（g/ml）的料液比溶解不同粒度的山竹殼粉末約50 g。

微波處理：用微波爐輔助處理溶有山竹殼原料乙醇溶液，以利于分離提取。

超濾：用超濾裝置進(jìn)行分離，分別針對不同溶劑濃度、粒度、微波處理時間、微波功率進(jìn)行超濾以確定最佳的提取條件。

測量：用30%乙醇-0.108%HCl混合液提取劑作為參比溶液，將待測液置于520 nm波長下進(jìn)行吸光度A測定。同樣將其它試驗組吸光度測定出來，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得出提取率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用分析軟件SPSS17.0 for Windows對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。不同處理的樣品數(shù)據(jù)顯著性差異采用一般線形模型方差分析(ANOVA，LSD檢驗)進(jìn)行檢驗，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值(S)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 山竹殼色素類物質(zhì)超濾法分離的正交試驗

試驗采用4因素3水平的正交試驗設(shè)計，在料液比為1∶10（g/ml）,所用溶劑為220 ml，山竹殼顆粒質(zhì)量為50 g，山竹殼顆粒粒度、提取劑乙醇濃度、微波作用時間、微波功率4因素3水平條件下提取效果如表2所示。

表2 山竹殼色素類物質(zhì)微波輔助結(jié)合超濾法分離的正交試驗結(jié)果

2.2 正交試驗的方差分析和回歸分析

由主體間效應(yīng)的檢驗可得：山竹殼粒度（A）和溶劑濃度(B)是影響山竹殼色素提取率大小的關(guān)鍵性因子(P＜0.05)。且隨溶劑濃度增加，山竹殼色素提取率有上升趨勢。隨著山竹殼粒徑減小，山竹殼色素提取率有上升趨勢。

由粒度在每個水平間的多重比較可得，30目與100目對吸光值影響差異不顯著(P＞0.05)，粒度在30目與200目對吸光值影響差異顯著（P＜0.05），100目與200目對吸光值影響差異不顯著(P＞0.05)，100目為提取試驗時應(yīng)該注重的因素水平。

由溶劑濃度在每個水平間的多重比較可得，溶劑濃度水平中1與2比較差異不顯著(P＞0.05)，水平1與3比較差異顯著(P＜0.05)，水平2與3比較對吸光值的影響差異顯著(P＜0.05)，則水平2和3為提取試驗時應(yīng)注重的因素水平。

因此，對山竹殼色素提取分離時，粒度和溶劑濃度對試驗結(jié)果的影響為主要因素，為試驗應(yīng)該嚴(yán)格控制的因素。

回歸分析得到模型：y=-2.619+0.36X1+0.482X2-0.16X3-0.184X4,(P＜0.05)

當(dāng)微波功率為160 W，作用時間為20 s時，方程變?yōu)椋簓=-31.899+0.36X1+0.482X2，所做響應(yīng)面圖見圖2。

根據(jù)正交試驗結(jié)果回歸方程可知：A取A2、B取B2、C取C1、D取D2時山竹殼色素提取率達(dá)最高，即在本試驗中山竹殼色素分離的最好條件為：A2B2C1D2，所以用A2B2C1D2組合進(jìn)行驗證試驗，試驗流程同上，最終得到的吸光度為1.121，小于6號處理組。而6號處理組A2B3C1D2的吸光度為1.316，是10個處理組合中吸光度最大的。即山竹外殼紅色素提取率最高的。所以，最優(yōu)處理組合為A2B3C1D2，即山竹殼粉末顆粒大小為過100目篩、提取溶劑為50%乙醇-0.108%HCl混合溶液、微波溶解功率為160 W、微波溶解時間為20 s。

3 討論

3.1 原料粒度對提取效果的影響

適宜的原料粒度有利于其中活性物質(zhì)的提取(馬雪松等，2006)，適宜的粒度不但增加了溶劑與原料的接觸面積，也減少了不必要的電力等能源的消耗。Chupin等(2015)研究了微波輔助法提取海岸松樹皮中活性物，發(fā)現(xiàn)在5種不同原料粒度下，提取得到的產(chǎn)物有差異。Krogell等(2013)研究了云杉皮木材中半纖維素的提取，0.5～12.5 mm不同粒徑木材顆粒對提取結(jié)果有強化作用，顆粒越小半纖維素得率越高。本試驗中原料的粒度分別為30目，100目，200目，不同的粒度對分離結(jié)果的影響差異顯著，結(jié)合粉碎耗能考慮，為了節(jié)約電力能源，粒度可以選擇100目大小。

3.2 溶劑濃度對提取效果的影響

溶劑濃度對提取效果的影響是一個重要因素，有些作者研究發(fā)現(xiàn)使用0.108%HCl-95%乙醇作為提取劑，提取山竹殼紅色素效果較好（胥秀英等，2006），李宇偉等(2012)研究金銀花中綠原酸的提取分離，發(fā)現(xiàn)乙醇用量為75%，時提取率較高，馬雪松等(2006)研究分離黃芪中甲苷，溶劑濃度60%效果最佳，溶劑濃度對試驗結(jié)果有顯著影響。本試驗中使用超濾裝置，結(jié)合方差分析和實際情況，溶劑濃度選在50%，溶劑濃度對分離結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

試驗過程中，已經(jīng)過濾好的山竹外殼紅色素溶液碰到蒸餾水時會產(chǎn)生一種乳白色的液體，其成分和結(jié)構(gòu)需要后續(xù)試驗進(jìn)行深入研究。

山竹殼色素具有一定的藥理及營養(yǎng)價值，其不僅對心血管系統(tǒng)有保護作用，且具備抗腫瘤、抗菌及抗氧化性等特性，可以說是一種安全可靠的天然食用色素，可以投入開發(fā)成食品和飼料添加劑。

3.3 超濾對提取效果的影響

本試驗中超濾對提取效果的影響沒有對照組，沒有直接數(shù)據(jù)說明其作用。而從膜過濾的特征來看，納濾、反滲透、超濾膜過濾具設(shè)備規(guī)模小、能耗低、分離效率高的特點。膜分離技術(shù)具有一系列優(yōu)點：膜分離過程的能耗比較低、適合熱敏性物質(zhì)分離、分離裝置簡單、操作方便、工藝適應(yīng)性強、便于回收、沒有二次污染。也有研究者采用分子印記法（Piacham等，2015)、超臨界CO2法（Mishima等，2013)分離山竹中活性物質(zhì)，

4 結(jié)論

本試驗采用4因素3水平正交設(shè)計，分別對山竹殼顆粒大小、溶劑濃度、微波溶解時間和微波溶解功率進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在料液比為1∶10的弱酸條件下，用過100目篩的山竹殼粉末、溶劑濃度為50%乙醇-0.108%HCl溶液、微波功率為160 W、微波溶解時間為20 s時，采用超濾結(jié)合微波輔助方法提取山竹殼紅色素，提取率為22.1%。本試驗的創(chuàng)新點在于采用了微波輔助與超濾膜分離相結(jié)合的方法，分離得到濃縮的山竹紅色素溶液，為未來人們將山竹殼紅色素開發(fā)成食品和飼料添加劑提供了一定的借鑒意義。