外源酶制劑評(píng)定的方法探討

■艾 琴 左建軍 趙江濤 馮定遠(yuǎn)

（1.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東云浮 527439；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；3.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮 527439）

我國飼用酶的研究始于20世紀(jì)70年代，80年代后期到90年代，飼用復(fù)合酶的研究、開發(fā)、應(yīng)用在我國同步進(jìn)行并被列入“八五”國家科技攻關(guān)項(xiàng)目，從此，飼用酶開始在我國廣泛推廣應(yīng)用。但是多年過去了，除植酸酶外，其他的外源非淀粉多糖（NSP）酶和消化酶的應(yīng)用仍然處于探索階段。究其原因，雖然目前外源酶制劑的評(píng)定方法較多，但缺乏統(tǒng)一性、標(biāo)準(zhǔn)化和有效性，眾多評(píng)價(jià)方法對(duì)生產(chǎn)應(yīng)用的指導(dǎo)性不強(qiáng)。本文結(jié)合家禽消化道條件，著重總結(jié)了體內(nèi)養(yǎng)分消化率和體外模擬法兩類評(píng)定方法在外源酶制劑評(píng)定中的應(yīng)用，旨在為后期的外源酶評(píng)定提供理論基礎(chǔ)。

體內(nèi)養(yǎng)分消化率測(cè)定法又稱生物學(xué)評(píng)定法，目前應(yīng)用較多的有肛門全收糞法、排空-強(qiáng)飼法和回腸末端消化產(chǎn)物法（見表1）。體外模擬法是體內(nèi)外模擬動(dòng)物消化道的黑箱環(huán)境進(jìn)行的一系列消化吸收試驗(yàn)，筆者根據(jù)近年來體外模擬中選用消化酶來源的不同，將其劃分為外源酶評(píng)定、內(nèi)源酶評(píng)定和仿生酶評(píng)定三種。以下分別進(jìn)行論述。

表1 常用外源酶制劑體內(nèi)和體外養(yǎng)分消化率評(píng)定方法

1 外源酶制劑體內(nèi)養(yǎng)分消化率評(píng)定法

1.1 評(píng)定方法簡(jiǎn)介

全收糞法（Total Excreta）是經(jīng)典的傳統(tǒng)消化實(shí)驗(yàn)方法，是一切消化實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)場(chǎng)地的準(zhǔn)備和要求較高，例如，首先需要選擇健康有代表性的動(dòng)物，且要達(dá)到一定的規(guī)模，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過少，測(cè)值代表性差，若過多，測(cè)值準(zhǔn)確性雖略有提高，但費(fèi)用和工作量都增加，且難以精確統(tǒng)計(jì)飼料的攝入量。其次，需要無損地收集所有受試動(dòng)物的全部糞便，并需精細(xì)剔除糞便中可能存在的羽毛、皮屑、飼料等雜質(zhì)，否則嚴(yán)重影響測(cè)值的準(zhǔn)確性。工作強(qiáng)度非常之大，因此，在傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)研究中該方法逐漸被排空-強(qiáng)飼法取代。

排空-強(qiáng)飼法（Emptying-force-feeding）又稱真代謝能法，基本操作過程包括36 h的饑餓期和48 h的排泄物收集期，強(qiáng)飼量為25 g，同期測(cè)定內(nèi)源養(yǎng)分損失以矯正養(yǎng)分利用率。該方法既可準(zhǔn)確地測(cè)定飼料的攝入量，也大大降低了殘留在消化道內(nèi)的食糜對(duì)排泄物的影響，是目前飼料原料價(jià)值評(píng)定的主要方法，但其在外源酶制劑評(píng)定中的適用性尚需驗(yàn)證。

回腸末端消化法（Ileal digesta）的基本操作過程為，家禽頸部脫臼或家畜宰殺后，迅速剖開腹部，結(jié)扎卵黃囊憩室和回盲腸結(jié)合部腸段，采集該段消化道內(nèi)容物測(cè)定養(yǎng)分消化率。該法雖然可獲得整個(gè)消化道的系統(tǒng)信息，但耗費(fèi)試驗(yàn)動(dòng)物較多，采樣時(shí)間難以一致，且樣本缺乏延續(xù)性。為了解決以上問題，研究人員相繼成功建立了單胃動(dòng)物回腸瘺管模型。該模型的建立為研究單胃動(dòng)物回腸末端消化的時(shí)間和空間變化以及采樣時(shí)間的確定提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。但是相對(duì)于體型較小、抗應(yīng)激性較差的家禽，其手術(shù)操作風(fēng)險(xiǎn)較大。

1.2 三種體內(nèi)養(yǎng)分消化率評(píng)定法的比較

全收糞法（Total Excreta）、排空-強(qiáng)飼法（Empty?ing-force-feeding）和回腸末端消化法（Ileal digesta）比較研究發(fā)現(xiàn)，排空-強(qiáng)飼法多用于飼料原料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，該方法較好地規(guī)避了原料間的互作效應(yīng)，可較為精確地控制采食量和排泄量，但對(duì)受試雞的應(yīng)激性較大，且持續(xù)時(shí)間短，對(duì)酶制劑評(píng)定的適用性有待驗(yàn)證。與肛門全收糞法相比，回腸末端收糞法排除了后腸微生物對(duì)養(yǎng)分消化率的影響，理論上可更真實(shí)地反映酶制劑作用效果，但受腸道排空速度的影響，各段腸道食糜量變異較大，樣品容易缺乏代表性。對(duì)于三種生物學(xué)法在酶制劑應(yīng)用中的比較研究較少，目前僅見一篇文獻(xiàn)報(bào)道：在測(cè)定酶制劑對(duì)蛋白消化率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)三種生物學(xué)法具有相同的變化趨勢(shì)。

2 外源酶制劑體外模擬消化法

數(shù)年來科學(xué)家們一直在探索畜禽消化道環(huán)境，并試圖建立高模擬度的仿生消化系統(tǒng)?？偨Y(jié)各種文獻(xiàn)資料，體外消化法按照模擬所使用的消化酶酶譜及來源不同可分為三類：外源酶法、內(nèi)源酶法和仿生酶法。

2.1 外源酶法

外源酶法的代表為Boisen等（1995）建立的以胃蛋白酶和豬胰液素模擬動(dòng)物胃和腸期消化酶為主的消化程序。根據(jù)不同的模擬階段又分為一步法和兩步法。一步法主要模擬胃部的消化過程，即胃酶水解法。該法主要用來評(píng)定飼料中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值。所用胃酶主要有胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和鏈霉蛋白酶。但目前應(yīng)用最多的還是胃蛋白酶，因?yàn)閯?dòng)物體內(nèi)胃部的主要消化酶是胃蛋白酶，胃部其它酶含量很低，因此，采用胃蛋白酶進(jìn)行體外模擬更接近動(dòng)物的實(shí)際生產(chǎn)情況，使體外法所測(cè)得的結(jié)果具有代表性。但這個(gè)方法測(cè)定結(jié)果易受pH值和胃蛋白酶劑量的影響。筆者實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值越低，胃蛋白酶活性越高，所測(cè)得蛋白質(zhì)消化率高。保持pH值不變，胃蛋白酶劑量越大，所測(cè)得蛋白體外消化率越高，但這樣評(píng)價(jià)的飼料蛋白體外消化率基本沒有差別，因?yàn)楫?dāng)胃蛋白酶劑量足夠高時(shí)，低質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料也將被全部降解。而且胃部酶解法只模擬了胃部的消化過程，沒有考慮后腸段的消化，蛋白質(zhì)飼料除了受胃蛋白酶降解外，還受到小腸中胰蛋白酶、糜蛋白酶的降解和大腸中一些微生物的降解。因此，胃部酶解法只能作為初步的蛋白質(zhì)飼料評(píng)價(jià)方法。兩步法主要模擬胃部和小腸部的消化過程，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶法或胃蛋白酶-胰液素法。據(jù)報(bào)道，胃蛋白酶-胰蛋白酶法可以準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)飼料的體外消化率，并與體內(nèi)消化率有極強(qiáng)的相關(guān)性，但對(duì)礦物質(zhì)及配合飼料的評(píng)價(jià)準(zhǔn)確率較差。因?yàn)樾∧c的消化酶除了胰蛋白酶外，還含有淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶等等。因此只有充分考慮各種酶的綜合效應(yīng)才能得到準(zhǔn)確的體外評(píng)價(jià)效果。胃蛋白酶-胰液素法是目前應(yīng)用最多的兩步法，胰液素中包含了小腸中主要的消化酶類，并且胰液素已經(jīng)商品化，穩(wěn)定性較好，但胰液素沒有考慮以不同動(dòng)物之間酶譜的差異性，因此精確性較差。

2.2 內(nèi)源酶法

內(nèi)源酶法指在胃蛋白酶水解的基礎(chǔ)上，輔以模擬小腸的pH值、溫度及消化酶濃度。小腸液是直接從動(dòng)物體內(nèi)獲取的消化液，這更接近動(dòng)物的消化實(shí)際，但所用消化液含有的消化成分變動(dòng)幅度較大，穩(wěn)定性差，用此方法測(cè)出的結(jié)果可比性差。此外，雖然Saka?moto等(1980)、盧福莊等(1985)和杜榮等(1995)均證明利用豬的消化酶譜來模擬雞體內(nèi)消化過程是可行的，但亦有研究指出雞十二指腸及后腸液中胰蛋白酶和糜蛋白酶活性遠(yuǎn)高于豬小腸液中的，且豬胰液素中酶的活性及組成、酶水解條件是制約該方法準(zhǔn)確評(píng)定雞日糧體外消化能的主要限制因素，因此，該方法已逐漸退出了體外評(píng)定體系。

2.3 仿生消化酶法

仿生消化酶法指通過體內(nèi)試驗(yàn)測(cè)定畜禽各段消化道的pH值、溫度及消化酶酶譜和濃度，然后利用定標(biāo)的商品單酶制劑配制。圍繞家禽消化液中酶譜的組成，我國科研人員研發(fā)了適用于禽類的“空腸T型瘺管”，并在此基礎(chǔ)上相繼探索了北京鴨和黃羽肉雞消化液中酶譜組成及小腸食糜流量變化規(guī)律，研制了一套適用于黃羽肉雞的仿生消化液試劑盒，并在前期獲取的家禽胃腸道消化生理參數(shù)及手工模擬消化操作過程基礎(chǔ)上，開發(fā)了“單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)”。

比較外源酶法和仿生酶法胃期和腸期主要參數(shù)可見（見表2），仿生消化法縮短了胃期和腸期消化時(shí)間，并將腸期分為小腸前段和后段，分別采用不同的緩沖液，且在腸期使用家禽模擬小腸液?？梢姡律ú僮鞒绦?qū)仪菹淼哪M程度更高，且實(shí)現(xiàn)了半自動(dòng)化操作，有效降低了系統(tǒng)誤差。但是無論外源酶法還是仿生消化法，其開發(fā)目的均為飼料原料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定，因此，在胃期和腸期胃蛋白酶和胰液素或人工小腸液的添加濃度均為過量。而待測(cè)日糧（配合飼料）的添加量僅為2 g，若按照大生產(chǎn)中外源酶的添加量500 g/t計(jì)算，2 g配合日糧中外源酶的添加量（質(zhì)量）僅為1 mg，如此微量的蛋白類物質(zhì)在過量模擬胃液和小腸液的作用下，酶活力存留率為多少尚未見詳盡報(bào)道，因此，確定體外消化過程中酶制劑的適宜添加量是建立酶制劑體外消化評(píng)估方法可行性的參數(shù)之一。

表2 Boisen(1991)法與仿生消化法胃期和腸期主要參數(shù)比較

此外，體外消化法測(cè)定值較好地回歸校正到體內(nèi)養(yǎng)分消化率測(cè)定值是檢測(cè)體外模擬消化可行性的重要標(biāo)準(zhǔn)。但相關(guān)研究報(bào)道較少，僅見Bedford（1993）、張鐵鷹（2002）和王寧娟（2009）分別對(duì)添加酶制劑后食糜黏度、日糧磷利用率及干物質(zhì)、粗蛋白、能量、鈣、磷消化率進(jìn)行了體內(nèi)外評(píng)價(jià)相關(guān)性檢驗(yàn)，證明各自建立的體外評(píng)價(jià)體系可較好地反映酶制劑體內(nèi)的生物學(xué)效價(jià)，其重復(fù)性有待驗(yàn)證。

3 家禽消化道內(nèi)環(huán)境對(duì)酶制劑體外評(píng)定的影響

長久以來，酶制劑體外評(píng)定程序較好地借用了飼料原料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定程序，隨著飼料原料營養(yǎng)價(jià)值評(píng)定程序的不斷規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、精確化，酶制劑的體外評(píng)定程序也將日趨完善。但在此過程中，我們必須區(qū)分其目的性，酶制劑的評(píng)定其主要評(píng)定對(duì)象是酶制劑，其活力的體現(xiàn)受家禽消化道內(nèi)環(huán)境的影響。In?borr等(1993)利用體外消化模擬法對(duì)木聚糖酶和一種飼用復(fù)合酶在單胃動(dòng)物前段消化道內(nèi)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，低pH值、胃蛋白酶和胰酶均能夠使飼用酶活性降低，飼用酶活穩(wěn)定性受三者的影響具有相似變化趨勢(shì)。Almirall等(1995)體內(nèi)外條件下，低、中、高pH值和添加胃蛋白酶或胰酶對(duì)β-葡聚糖酶活力影響的研究中也得出同樣結(jié)論。為了提高體外模擬程度，使酶制劑的評(píng)價(jià)更加客觀性，本文總結(jié)了雞各消化道的pH值范圍(見表3)，結(jié)果顯示，嗉囊、腺胃、肌胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸分別為：4.56～6.29、3.09～5.20、2.69～4.02、4.78～6.57、5.63～8.12、5.87～8.79、4.96～6.20，其中胃期pH值均高于傳統(tǒng)模型中選用的pH值2.0。此外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，仿生消化模型中使用的胃蛋白酶能夠使飼用酶活力降低。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，在pH值一定時(shí)，不同菌種來源的木聚糖酶對(duì)胃蛋白酶或胃蛋白酶-胰蛋白酶表現(xiàn)出不同的耐受性，且有研究指出，胃蛋白酶對(duì)木聚糖酶活力的影響更大，因此，適宜胃蛋白酶水平是確保體外消化評(píng)定飼料營養(yǎng)價(jià)值和飼用酶作用效果可靠性的另一關(guān)鍵因素。但目前使用的體外消化法中，胃蛋白酶濃度和胃期消化時(shí)間卻無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。由表4可見，當(dāng)以豬為試驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，胃蛋白酶濃度從0.56～220 U/(ml反應(yīng)體積)不等，而雞的胃蛋白酶濃度則有用到2 000 U/(ml反應(yīng)體積)；消化時(shí)間則從0.75～6 h不等。張鐵鷹（2002）研究認(rèn)為，腺胃和肌胃食糜中胃蛋白酶水平與日齡呈3次曲線關(guān)系（y=1E-06x3-0.000 4x2+0.034x+0.096，R2=0.708 5；其中，y為胃蛋白酶水平，x為日齡），根據(jù)該回歸方程可以計(jì)算出任意日齡肉仔雞消化道食糜中胃蛋白酶的酶活水平。然而，胃、腸道蛋白酶酶活水平受日糧類型和晝夜規(guī)律的影響無法精確定量。雖然胃蛋白酶對(duì)木聚糖酶作用方式及機(jī)制的研究目前尚不清楚，但隨著微膠囊包被、控釋技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，外源酶制劑耐酸和耐胃蛋白酶的性質(zhì)將隨使用目的的不同而呈現(xiàn)產(chǎn)品多樣化。

4 結(jié)語

許多學(xué)者認(rèn)為外源酶制劑效果的評(píng)價(jià)除了考慮該酶的酶學(xué)性質(zhì)外，還應(yīng)同時(shí)考慮家畜的內(nèi)環(huán)境。上文綜述顯示，目前的體外模擬評(píng)定體系建立與參數(shù)選用較多沿用了單胃動(dòng)物飼料原料能量的體外評(píng)定方法，并未完全考慮動(dòng)物的消化道環(huán)境和外源酶制劑的適用性。因此，所測(cè)數(shù)據(jù)可能無法代表外源酶的實(shí)際作用效果。此外，體外模擬法測(cè)定值必須回歸校正生物學(xué)法才具有生物學(xué)意義，而全收糞法、回腸末端收糞法和排空-強(qiáng)飼法三種體內(nèi)消化率測(cè)定值雖在酶制劑評(píng)定中均有應(yīng)用，但由于各種方法對(duì)所測(cè)指標(biāo)的適用性不同導(dǎo)致消化試驗(yàn)結(jié)果差異較大，所測(cè)數(shù)據(jù)及所建立的回歸方程不具有代表性和適用性。因此，為了使外源酶制劑的評(píng)定方法更加規(guī)范化，評(píng)定數(shù)據(jù)具有可比性、適用性和實(shí)際價(jià)值，適宜體內(nèi)消化率測(cè)定方法的選擇和體外模擬參數(shù)及方法的確定顯得尤為重要。

表3 雞各段消化道pH值

表4 體外模擬法胃期反應(yīng)體系中胃蛋白酶濃度

（參考文獻(xiàn)42篇，刊略，需者可函索）