西格列汀對(duì)2型糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)因子表達(dá)的影響

吳彥菊，關(guān)一夫

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，沈陽(yáng)110122)

西格列汀是一種二肽基肽酶4(DPP-4)抑制劑，是治療2型糖尿病的新型藥物。其主要通過(guò)高選擇性抑制DPP-4，增加血中有活性胰高血糖素樣多肽1(GLP-1)，促進(jìn)胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，發(fā)揮改善血糖調(diào)控的作用，且低血糖等不良反應(yīng)發(fā)生率低［1～3］。研究表明，西格列汀單一及聯(lián)合用藥，具有抑制胰島β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)β細(xì)胞增殖，改善胰島β細(xì)胞功能的作用［3～5］。但是，其改善胰島β細(xì)胞功能的確切機(jī)制尚需深入研究。胰島β細(xì)胞功能進(jìn)行性衰竭是2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。有研究在2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞中檢測(cè)到了自噬體及自噬相關(guān)因子的表達(dá)［6］，提示自噬參與胰島β細(xì)胞進(jìn)行性衰竭的過(guò)程。2014年4～9月，我們從動(dòng)物整體水平探究西格列汀對(duì)胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)因子 Atg12、Atg3及 Beclin1表達(dá)的影響，觀察其與改善胰島β細(xì)胞功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性db/db小鼠，共30只，由南京模式動(dòng)物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建及分組 西格列汀(默沙東，美國(guó));RNA提取試劑盒(Omega，美國(guó));逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國(guó));RT-PCR試劑盒(Takara，日本);兔抗Beclin1抗體(Abcam，美國(guó));抗胰島素抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó));抗胰高血糖素抗體(Abcam，美國(guó));標(biāo)記Alexa-488及Alexa-596的二抗(Jackson，美國(guó));SABC免疫組化試劑盒(博士德，武漢)。胰島素 ELISA試劑盒(Millipore，美國(guó))。酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))，血糖儀及試紙(強(qiáng)生，美國(guó))，低溫立式離心機(jī)(KUBOTA，日本)，熒光定量 PCR 儀(ABI，美國(guó))，化學(xué)發(fā)光儀(Thermo，美國(guó))，共聚焦顯微鏡(OLYMPUS，日本)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，經(jīng)尾靜脈取血檢測(cè)血糖，30只小鼠血糖均超過(guò)16.7 mmol/L，視為糖尿病動(dòng)物模型構(gòu)建成功。將db/db小鼠隨機(jī)為2組:糖尿病對(duì)照組(DC組)與西格列汀治療組(DT組)，每組15只。DT組小鼠每日晨9時(shí)灌胃給予西格列汀(80 mg/kg)1次，DC組小鼠給與等體積飲用水灌胃，共干預(yù)5周。實(shí)驗(yàn)用db/db小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中，鼠籠、飲水瓶等用具均經(jīng)高壓滅菌消毒，SPF級(jí)飼料喂養(yǎng)，每日更換墊料及飲用水，維持室溫24～26℃，濕度55% ～65%，12 h照明。

1.2.2 標(biāo)本收集 治療5周后，將所有小鼠以頸椎脫臼法處死，打開腹腔，剝離完整胰腺;生理鹽水沖洗，將胰腺?gòu)闹醒肫食蓛刹糠郑话雰龃嬗谝旱校糜谔崛NA及組織胰島素;另一半浸泡于4%多聚甲醛溶液固定，以制備石蠟切片。血標(biāo)本以心臟穿刺法采取，4℃離心(3 000 r/min，10 min)后，分離血清，－20℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.3 血糖水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)期間，每周給藥前檢測(cè)小鼠血糖1次，血標(biāo)本經(jīng)尾靜脈穿刺采取，血糖值以強(qiáng)生血糖儀檢測(cè)，采血前小鼠禁食2 h。

1.2.4 血清及胰腺組織胰島素檢測(cè) 血標(biāo)本經(jīng)尾靜脈穿刺采取，ELISA法檢測(cè)血清胰島素。取綠豆大小胰腺組織，加入1 mL預(yù)冷的鹽酸乙醇溶液，冰上充分研磨，4℃孵育16 h。4℃離心(12 000 r/min，5 min)后，取上清，ELISA法檢測(cè)胰島素濃度。向各樣品離心后的沉淀中加入1 mL RIPA裂解液，制備蛋白樣品，并測(cè)定蛋白濃度。測(cè)得胰島素濃度與蛋白濃度的比值即為各樣品組織胰島素的含量。

1.2.5 胰腺組織胰島素與胰高血糖素檢測(cè) 采用免疫熒光染色。胰腺組織石蠟切片的處理流程與免疫組化一致。加入稀釋后的抗胰島素抗體(1∶800)與胰高血糖素抗體(1∶2 000)，4℃孵育14 h;Alexa-488及Alexa-596標(biāo)記的二抗(1∶200)，室溫孵育2 h;加入熒光二抗后，所有操作均避光;甘油封片，共聚焦顯微鏡觀察并拍照(×200)。胰島素陽(yáng)性染色區(qū)即β細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，胰高血糖素陽(yáng)性染色區(qū)即α細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。

1.2.6 胰腺組織Caspse3活性檢測(cè) 將1 mL預(yù)冷的RIPA裂解液加入黃豆大小胰腺組織中，冰上研磨，孵育30 min。4℃離心(12 000 r/min，20 min)后，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照Caspase3活性檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，以化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)待測(cè)樣品的生物熒光強(qiáng)度(RLU)。測(cè)得生物熒光強(qiáng)度(RLU)與蛋白含量(μg)的比值即為各樣品有活性Caspase3的含量。

1.2.7 胰島 β 細(xì)胞 Atg3、Atg12及 Beclin1基因檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。按照Omega試劑盒操作指南提取總RNA;逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物以Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由金思瑞生物科技公司合成，序列如下:Atg3引物:上游 5'-ACGCTGGAGGTGAAGATG-3'，下 游 5'-CCTGCATGGGTGAACTGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為236 bp。Atg12引物:上游5'-TTGGAGGCATAGACAGACAC-3'，下游 5'-TATGTGTATTCCGTGCCATC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 200 bp。Beclin1引物:上游5'-GTTGCCGTTATACTGTTCTG-3'，Beclin1 下游 5'-CCTCCAGTGTCTTCAATC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 180 bp。GAPDH引物:上游 5'-CCATGTTTGTGATGGGTGTGAACCA-3'，下游 5'-ACCAGTGGATGCAGGGATGATGTTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 251 bp。反應(yīng)體系(25 μL):cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，上、下游引物(濃度 5 μmol/L)各 1 μL，滅菌蒸餾水 8.5 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃，30 s;變性95 ℃，30 s;退火58 ℃，30 s;延伸72℃，30 s;共38個(gè)循環(huán)。以GAPDH為管家基因，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)。

1.2.8 胰島β細(xì)胞Beclin1蛋白檢測(cè) 將固定后的胰腺組織制備成4 μm的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化等處理后，采用SABC法檢測(cè)Beclin1蛋白表達(dá)。滅菌PBS稀釋的抗Beclin1抗體(1∶100)，4℃孵育14 h;HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育30 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染并封片。倒置顯微鏡觀察胰島組織，每張切片選取3個(gè)不重疊視野拍照(×400)，Image proplus軟件計(jì)算胰島Beclin1陽(yáng)性表達(dá)區(qū)的平均光密度值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血糖水平比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組血糖水平比較(n=15，±s)

表1 兩組血糖水平比較(n=15，±s)

組別 血糖(mmol/L)第1周 第2周 第3周 第4周 第5周DC 組 21.55 ±3.14 24.26 ±3.13 26.50 ±3.01 28.54 ±3.16 30.96 ±2.92 DT 組 21.66 ±2.83 24.08 ±2.22 24.49 ±2.00 23.78 ±1.89 22.17 ±1.94 t 0.11 0.18 2.16 4.98 9.70 P 0.916 0.856 0.039 0.000 0.000

2.2 兩組血清胰島素及組織胰島素比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組血清胰島素及組織胰島素比較(±s)

表2 兩組血清胰島素及組織胰島素比較(±s)

組別 n 血清胰島素(ng/mL)組織胰島素DC組6 5.02 ±0.83 15.39 ±3.51 DT 組 6 7.34 ±0.96 33.31 ±3.73 t 4.46 8.56 P 0.001 0.000

2.3 兩組胰腺組織胰島素與胰島血糖素檢測(cè)結(jié)果DC組小鼠胰島α細(xì)胞(胰島素)散布于胰島中，所占比例大;DT組小鼠β細(xì)胞(胰島血糖素)所占比例大，分布于胰島的中央，α細(xì)胞分布于胰島的周邊，所占比例小。見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖9。

2.4 兩組胰腺組織 Caspase3活性比較 DC組caspase3 活性為3.07 ±0.73，DT 組為1.72 ±0.42，t=3.94，P=0.002。

2.5 兩組胰島β細(xì)胞Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 兩組胰島β細(xì)胞Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)比較(±s)

表3 兩組胰島β細(xì)胞Atg3、Atg12及Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)比較(±s)

組別 n Atg3 Atg12 Beclin1 DC組8 0.290 ±0.060 0.024 ±0.005 0.165 ±0.019 DT 組 8 0.174 ±0.039 0.019 ±0.013 0.087 ±0.013 t 4.546 8.088 9.426 P 0.001 0.000 0.000

2.6 兩組胰島β細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)比較 棕黃色染色區(qū)即為Beclin1陽(yáng)性表達(dá)區(qū)，主要位于胰島β細(xì)胞胞質(zhì)，見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖10。半定量分析發(fā)現(xiàn)，DC組與DT組小鼠胰島β細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)分別為 12.37 ±2.11和 7.43 ±1.23，P ＜0.01。

3 討論

西格列汀無(wú)論短期還是長(zhǎng)期治療均可發(fā)揮降糖及改善胰島β細(xì)胞功能的作用［4，5］。在本研究中，西格列汀治療降低了2型糖尿病小鼠的血糖水平。免疫熒光染色結(jié)果顯示，西格列汀治療后，糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞所占比例大，位于胰島的中央，α細(xì)胞位于胰島周邊，分布趨于正常。進(jìn)一步檢測(cè)胰島素水平發(fā)現(xiàn)，DT組小鼠血清胰島素及組織胰島素水平較DC組顯著增加，提示西格列汀治療增強(qiáng)了糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞合成及分泌胰島素的能力，改善血糖調(diào)控及β細(xì)胞功能。

既往研究表明，拮抗β細(xì)胞凋亡是西格列汀改善胰島β細(xì)胞功能的重要機(jī)制［7］。隨著研究者對(duì)自噬深入探究，逐步發(fā)現(xiàn)自噬與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。自噬，又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是指將細(xì)胞中的大分子物質(zhì)和細(xì)胞器等運(yùn)輸至自噬溶酶體進(jìn)行大量降解的生物學(xué)過(guò)程［8］。Beclin1、Atg3及 Atg12等多種自噬相關(guān)蛋白參與自噬體的形成，并通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。本研究已在糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞中檢測(cè)到Atg3、Atg12及Beclin1等自噬相關(guān)因子的表達(dá)，且西格列汀治療后，2型糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞中自噬相關(guān)因子Atg3、Atg12及Beclin1的表達(dá)顯著減低，伴Caspase3活性降低。Caspase3是細(xì)胞凋亡的終末執(zhí)行者，其活性降低表明西格列汀治療拮抗了β細(xì)胞凋亡。Beclin1，哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)基因，主要參與自噬泡膜與溶酶體膜融合的調(diào)節(jié)［9］。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)自噬基因 Beclin1，可顯著增加細(xì)胞凋亡率［10］，說(shuō)明Beclin1是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要因子。目前認(rèn)為，Beclin1主要通過(guò)與Bcl-2蛋白作用調(diào)控凋亡［11］。Atg12，泛素樣蛋白家族成員，主要參與自噬體膜延伸的調(diào)節(jié)［12］，亦通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。在Atg12結(jié)構(gòu)中，含有一個(gè)BH3樣結(jié)構(gòu)域，能與Bcl-2家族成員如Bcl-2、Mcl-1結(jié)合，拮抗其抗凋亡的作用，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡［13］。Atg3，LC3泛素樣系統(tǒng)中的一員，可催化可溶性LC3-I轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄訪C3-Ⅱ，調(diào)節(jié)自噬泡膜融合與延伸［14］。Wang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，人 SKM-1 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Atg3，細(xì)胞凋亡率顯著增加。Atg3還可通過(guò)Atg12可與共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，經(jīng)線粒體途徑，引發(fā)細(xì)胞凋亡［16］。已有研究表明，抑制Beclin1等自噬相關(guān)因子的表達(dá)，可拮抗胰島 β細(xì)胞凋亡［17，18］。由此推測(cè)，在本研究中，西格列汀對(duì) Atg3、Atg12及Beclin1的下調(diào)作用，與其抑制胰島β細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)。

綜上所述，西格列汀治療改善了2型糖尿病小鼠的血糖調(diào)控，抑制了β細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)了β細(xì)胞合成及分泌胰島素的能力;其對(duì)胰島β細(xì)胞自噬相關(guān)因子Atg3、Atg12及Beclin1的下調(diào)作用，可能是其改善胰島β細(xì)胞功能的新機(jī)制。本課題從全新的角度探究了西格列汀保護(hù)2型糖尿病胰島β細(xì)胞的機(jī)制，為該藥物的臨床應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

圖8 p53基因PCR擴(kuò)增電泳圖(部分)及測(cè)序峰圖

圖9 兩組胰腺組織胰島素與胰高血糖素免疫熒光染色（×200）

圖10 兩組胰島β細(xì)胞Beclin1蛋白免疫組化染色（×400）

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