大鼠腦動脈瘤形成過程中MMP-2、MMP-9動態(tài)變化及多西環(huán)素對其的抑制作用

付強(qiáng)，呂濤，關(guān)俊宏

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

多項研究證實，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性異常增加參與了腦動脈瘤的形成，其中MMP-2和MMP-9倍受關(guān)注［1～3］。2011年2月 ～2012年5月，我們應(yīng)用大鼠腎性高血壓模型，通過RT-PCR和免疫組化兩種方法，在基因和蛋白水平動態(tài)觀察大鼠腦動脈瘤形成過程中MMP-2及MMP-9的表達(dá)變化，闡明其在腦動脈瘤形成過程中的作用;同時，應(yīng)用MMPs抑制劑多西環(huán)素干預(yù)腎性高血壓大鼠，通過抑制大鼠腦動脈瘤形成過程中異常增高的MMPs表達(dá)來阻止或延緩動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗中心提供?？勾笫驧MP-2單克隆抗體、抗大鼠MMP-9多克隆抗體、DNA marker(TIANGEN公司)，PCR儀(BIOER公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純;引物序列合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 將90只大鼠隨機(jī)分成對照組(n=10)、模型組(n=40)和治療組(n=40)。模型組和治療組腹腔注射10%水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉后，經(jīng)背肋緣下縱切口，用絲線結(jié)扎雙側(cè)腎動脈后支;術(shù)后1周用絲線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，1%鹽水代替飲水，建立大鼠腎性高血壓模型。治療組予以多西環(huán)素(1.5 mg/kg)混入飼料喂養(yǎng);模型組僅給普通飼料;對照組模擬手術(shù)，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 腦動脈瘤形成及動脈壁病理觀察 所有動物分別于術(shù)后 1、2、3 周及 1、2、3、4 個月處死，顯微鏡下仔細(xì)觀察顱底右側(cè)動脈環(huán)及其主要分支并將其剝離，光鏡下觀察動脈瘤形成情況及動脈壁病理變化。

1.2.3 腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白檢測 采用免疫組化染色。脫蠟和水化腦動脈壁組織切片，依據(jù)一抗要求預(yù)處理;3%甲醇—過氧化氫室溫去離子水孵育10 min，阻斷過氧化物酶活性;滴加一抗MMP-2、MMP-9(1∶50稀釋)，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗5 min×3次;滴加二抗IgG工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。DAB溶液顯色，自來水沖洗。常規(guī)復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對照用 PBS來替代一抗，其余同上。

1.2.4 腦動脈壁MMP-2、MMP-9基因檢測 RTPCR法檢測MMP-2、MMP-9 mRNA在腦動脈中的表達(dá)。TRIzol一步法提取腦動脈總RNA，紫外分光儀測定RNA含量。采用TIANGEN成套試劑盒，β-actin作內(nèi)參，自行設(shè)計引物。MMP-2正義序列為5＇-GGAAGCATCAAATCGGACTG-3＇，反義序列為 5＇-GGATACGGTCAGCACCTTTC-3＇;MMP-9 正義序列為5＇-GAATCACGGAGGAAGCCAAT-3＇，反義序列為 5＇-TAGCCCCAACTTATCCAGACT-3＇;β-actin 正義序列為 5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3＇，反義序列為5＇-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3＇。RT-PCR反應(yīng):取2 μg總RNA加入50 μL反應(yīng)體系中，循環(huán)參數(shù)RT:42℃，50 min;PCR:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)30個循環(huán)擴(kuò)增后72℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析儀進(jìn)行條帶灰度掃描，結(jié)果以目的基因與β-actin灰度比值表示。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦動脈瘤形成及動脈壁病理改變比較模型組中11只可見動脈瘤形成，主要位于右大腦前動脈—嗅動脈分叉部;動脈壁表現(xiàn)為內(nèi)膜墊、內(nèi)彈力膜完全消失，外膜增厚，成纖維細(xì)胞增生，肌層平滑肌消失，血管壁呈動脈瘤樣擴(kuò)張(插頁Ⅳ圖12);其余大鼠有不同程度動脈瘤樣改變。治療組僅有6只于右側(cè)顱底動脈環(huán)前半動脈分叉部可見動脈壁輕度隆起，余大鼠無動脈瘤樣改變。對照組大鼠右側(cè)顱底動脈分叉部無上述改變。

2.3 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較見表1。模型組陽性顆粒主要位于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞質(zhì)，MMP-2、MMP-9則表達(dá)在胞質(zhì)，呈棕黃色染色。動脈各段陽性顆粒分布不均勻，在動脈瘤樣改變處分布更為密集(插頁Ⅳ圖13)。治療組腦動脈壁MMP-2及MMP-9表達(dá)被抑制，其中MMP-9的抑制更為顯著。隨著時間推移，MMP-2及MMP-9表達(dá)僅有輕度增加，無高峰期出現(xiàn)(插頁Ⅳ圖14)。對照組大鼠腦動脈壁MMP-2及MMP-9僅少量表達(dá)(插頁Ⅴ圖15)。

2.4 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9基因比較 見圖1、圖 2。

3 討論

表1 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較(%，±s)

表1 各組腦動脈壁MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01。

組別 n MMP-2 MMP-9對照組10 5.58±0.62 4.79±0.58模型組 40術(shù)后1個月 13.12±1.59* 46.25±2.88*術(shù)后2個月 14.12±2.25* 48.77±2.65*術(shù)后3個月 15.02±1.23* 49.88±2.53*術(shù)后4個月 14.98±1.36* 50.05±2.14*治療組 40術(shù)后1個月 7.11±0.67△ 8.35±0.63△術(shù)后2個月 7.27±0.62△ 8.98±0.67△術(shù)后3個月 7.88±0.64△ 8.83±0.54△術(shù)后4個月 7.33±0.69△ 8.57±0.51△

圖1 各組腦動脈壁MMP-2基因比較

圖2 各組腦動脈壁MMP-9基因比較

腦動脈瘤在人群中的發(fā)病率達(dá)1% ～3%，動脈瘤破裂出血常致患者傷殘，甚至死亡，預(yù)后一般較差。開顱手術(shù)及血管介入治療是現(xiàn)有的兩種有效治療手段，但兩種方式均為有創(chuàng)性的操作，存在不同程度的手術(shù)風(fēng)險及治療局限性。學(xué)者們期望通過研究腦動脈瘤的發(fā)病機(jī)制，應(yīng)用基因及藥物等手段，從病因?qū)W角度對腦動脈瘤進(jìn)行相關(guān)治療，從而達(dá)到預(yù)防或控制腦動脈瘤生長，降低其發(fā)病率及改善預(yù)后的目的。

圖12 模型組動脈瘤前期（HE染色，×400）

圖13 模型組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)（免疫組化法，×400）

圖14 治療組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)（免疫組化法，×400）

圖15 對照組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)（免疫組化法，×400）

MMPs是一組破壞細(xì)胞外基質(zhì)的鋅和鈣依賴性的蛋白溶解酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、非膠原糖蛋白和彈力蛋白，參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)，其中MMP-2、MMP-9與腦動脈瘤形成關(guān)系最為密切。近期研究［4］顯示，四環(huán)素類抗生素是潛在基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，其除抑制細(xì)菌蛋白合成而達(dá)到抗菌作用外，還是一種能影響細(xì)胞多種功能的藥物。多西環(huán)素就是一種化學(xué)修飾四環(huán)素類抗生素，已被用來降低主動脈瘤［5］、牙周疾病［6］、關(guān)節(jié)炎等疾病的組織分解，以及減少腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移及血管的生成。

本研究應(yīng)用免疫組化及RT-PCR法，系統(tǒng)動態(tài)觀察大鼠腦動脈瘤形成過程中MMP-2及MMP-9表達(dá)的變化。結(jié)果表明，在大鼠腎性高血壓形成早期，隨血壓升高，MMP-2、MMP-9表達(dá)開始升高;在腎性高血壓后期，隨血壓不斷升高，MMP-2、MMP-9表達(dá)維持在高水平狀態(tài)，MMP-9較MMP-2表達(dá)水平更高;同時，我們應(yīng)用安全有效劑量的多西環(huán)素來干預(yù)腎性高血壓大鼠作為治療組，與模型組對比，發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素能顯著抑制大鼠腦動脈瘤形成過程中增高的MMP-2、MMP-9，從而降低大鼠腦動脈瘤發(fā)生率。本實驗結(jié)果表明，在大鼠腦動脈瘤形成過程中，動脈壁經(jīng)歷了由完整到逐漸被破壞、最終完全喪失正常層狀結(jié)構(gòu)，成為動脈瘤壁的變化過程。MMP-2、MMP-9表達(dá)的異常升高破壞了大鼠腦動脈壁彈力蛋白，導(dǎo)致維持腦動脈壁韌性的主要結(jié)構(gòu)內(nèi)彈力膜斷裂、消失，此結(jié)果與文獻(xiàn)報道［7～11］相一致。同時，我們發(fā)現(xiàn)MMP-9異常表達(dá)較MMP-2更為明顯，為將來尋找有效抑制劑防治腦動脈瘤提供了參考靶點。

大量文獻(xiàn)已經(jīng)證明，多西環(huán)素易透過血腦屏障，具有長期用藥耐受性高、不良反應(yīng)小且使用方便、安全、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點。所以，多西環(huán)素作為一種神經(jīng)保護(hù)劑，在腦動脈瘤形成過程中可以起到降低疾病發(fā)生率的作用，但對于已形成的腦動脈瘤是否具有治療作用，還有待進(jìn)一步研究證實。

［1］Hobeika MJ，Thompson RW，Muhs BE，et al.Matrix metalloproteinases in peripheral vascular disease［J］.J Vasc Surg，2007，45(4):849-857.

［2］齊巍，趙繼宗，王碩，等.基質(zhì)金屬蛋白酶與腦囊性動脈瘤破裂的相關(guān)性研究［J］.北京醫(yī)學(xué)，2004，26(1):3-5.

［3］嚴(yán)廣斌.基質(zhì)金屬蛋白酶［J］.中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版)，2010，4(4):566.

［4］Huffman MD，Curci JA，Moore G，et al.Functional importance of connective tissue repair during the development of experimental abdominal aortic aneurysms［J］.Surgery，2000，128(3):429-438.

［5］蔣國會，李光勤.強(qiáng)力霉素的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2006，33(4):319-322.

［6］Schwartz Z，Lohmann CH，Wieland M，et al.Osteoblast proliferation and differentiation on dentin slices are modulated by pretreatment of the surface with tetracycline or osteoclasts［J］.J Periodontol，2000，71(4):586-597.

［7］Sottile J.Regulation of angiogenesis by extracellular matrix［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1654(1):13-22.

［8］Yamamoto D，Takai S.Pharmacological implications of MMP-9 inhibition by ACE inhibitors［J］.Curr Med Chem，2009，16(11):1349-1354.

［9］Raffetto JD，Khalil RA.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(2):346-359.

［10］Ishibashi R，Aoki T，Nishimura M，et al.Imidapril inhibits cerebral aneurysm formation in an angiotensin-converting enzyme-independent and matrix metalloproteinase-9-dependent manner［J］.Neurosurgery，2012，70(3):722-730.

［11］Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al.Leukocyte-derived matrix metallopmteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory following transient focal cerebral ischemia［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(2):558-568.