堿性成纖維細(xì)胞生長因子在構(gòu)建組織工程脂肪中的應(yīng)用

田亞菲， 劉 毅

堿性成纖維細(xì)胞生長因子在構(gòu)建組織工程脂肪中的應(yīng)用

田亞菲， 劉 毅

脂肪組織工程; 堿性成纖維細(xì)胞； 生長因子

生長因子對(duì)細(xì)胞的黏附、生長、增殖、遷移、分化、基因表達(dá)等多方面起著重要的調(diào)控作用，是構(gòu)建組織工程脂肪的重要一環(huán)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)因具有明顯的促進(jìn)組織血管化、干細(xì)胞增殖和成脂分化作用，在脂肪組織工程領(lǐng)域是一種比較理想的生長因子。筆者現(xiàn)就bFGF在脂肪組織工程中的應(yīng)用作一綜述。

1 bFGF的發(fā)現(xiàn)及生物學(xué)效應(yīng)

bFGF是由D Gospodarowiz 等于1974年在牛腦垂體中分離純化，因其對(duì)成纖維細(xì)胞系Balb/c3T3具有促有絲分裂、增殖效應(yīng)，且等電點(diǎn)為9.6而得名。bFGF是一種內(nèi)源性多肽生長因子，在促進(jìn)血管新生、細(xì)胞分裂及生長等方面，有強(qiáng)烈的生物活性。雖然人體內(nèi)含量甚微，但生理作用相當(dāng)廣泛，對(duì)中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞(纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞[1]、胚胎干細(xì)胞[2]等)，有較強(qiáng)的促有絲分裂和分化[3]作用，是一種高效的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子。此外，bFGF 還參與調(diào)控體內(nèi)血管新生的整個(gè)過程，其對(duì)新生血管形成過程中，毛細(xì)血管基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移增生、膠原合成、小血管腔狀結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而新生血管等均有明顯的促進(jìn)作用[4]。總之，bFGF具有趨化和促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分化，促進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合，修復(fù)軟硬組織，促進(jìn)胚胎發(fā)育、血管形成等多種生物學(xué)效能[5]。

2 bFGF促干細(xì)胞增殖分化作用

bFGF是公認(rèn)的具有誘導(dǎo)趨化、促有絲分裂的生長因子，在分化早期，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化起著非常重要的作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有自我更新、增殖及多向分化的潛能，可分化為 3個(gè)胚層來源的多種組織細(xì)胞(Y Jiang, 2002年)，是脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞之一。研究發(fā)現(xiàn)，bFGF具有很強(qiáng)的促細(xì)胞增殖效應(yīng)，可借助參與激活細(xì)胞外信號(hào)，調(diào)節(jié)激酶(Erkl/2)信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]，故bFGF可作為擴(kuò)增種子細(xì)胞BMSCs的有效方法[7]。黃桂玲和鄧宇[8]研究發(fā)現(xiàn)，bFGF在低濃度(1 μg/L)下能夠顯著促進(jìn)BMSCs增殖，并保持其穩(wěn)定的未分化狀態(tài)，這種優(yōu)化的擴(kuò)增方法將使BMSCs在用于脂肪組織工程方面具有更好的前景。Song等[9]將胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESCs)誘導(dǎo)為BMSCs后進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，添加4 ng/ml bFGF成脂誘導(dǎo)劑的脂肪細(xì)胞形成顯著高于未添加組，提示bFGF在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要的作用。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是由PA Zuk等(2001年)在抽脂術(shù)后，從脂肪組織廢棄液分離出的血管基質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)并獲取的干細(xì)胞。ADSCs是一種具有和BMSCs相近的生物學(xué)特性和免疫表型的干細(xì)胞[10]，ADSCs因具有取材方便、易于獲取、可多向分化等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其成為脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞之一[11]。徐揚(yáng)陽等[12]將不同濃度的重組人bFGF加入ADSCs的成脂誘導(dǎo)劑中，發(fā)現(xiàn) rh-bFGF能有效促進(jìn)ADSCs的增殖速率，加速ADSCs向脂肪細(xì)胞的分化，且40 ng/ml為其最佳濃度。可見，bFGF對(duì)成脂干細(xì)胞的增殖率、新形成脂滴的時(shí)間以及成熟脂肪細(xì)胞的蛋白表達(dá)，均有正向調(diào)節(jié)作用，也是脂肪組織工程良好的細(xì)胞因子。

3 bFGF的血管化作用

脂肪移植后的吸收問題一直困擾著臨床應(yīng)用，使其實(shí)施受到一定的限制。造成移植脂肪吸收的主要機(jī)制是由于脂肪細(xì)胞間質(zhì)較少，且易受損傷，移植后手術(shù)操作對(duì)脂肪細(xì)胞造成的損傷，血供的中斷及細(xì)胞營養(yǎng)的匱乏，使細(xì)胞隨之壞死、自溶、吸收，并由纖維組織替代，所以脂肪移植首要考慮的解決方案就是重建血液循環(huán)。bFGF可通過激活A(yù)kt/MMP-2信號(hào)通路等多種機(jī)制顯著誘導(dǎo)血管生成。 Monti等[13]發(fā)現(xiàn)，激活PKCε可顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌bFGF，而bFGF可上調(diào)VEGF受體的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。自體脂肪移植手術(shù)中加用bFGF，可以顯著提高自體脂肪的成活率，因?yàn)樵谝浦驳脑缙?，bFGF可促進(jìn)細(xì)胞增殖并維持細(xì)胞活力，而且能激活脂肪組織中的前脂肪細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化為成熟的脂肪細(xì)胞，從而促進(jìn)移植脂肪血管生成[14]。所以，將bFGF用于自體脂肪移植術(shù)可取得良好的臨床效果[15]。

在以ADSCs結(jié)合bFGF輔助顆粒脂肪移植中，蔣愛梅等[16]發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組(ADSCs+bFGF+顆粒脂肪組)形成的脂肪組織明顯高于對(duì)照組(ADSCs+顆粒脂肪組)，可見bFGF在發(fā)揮促血管生成作用的同時(shí)，還有明顯的促細(xì)胞分裂和增殖效應(yīng)，并且能增加未成熟的新生脂肪細(xì)胞的數(shù)量，使這些細(xì)胞增生成熟為大的脂肪細(xì)胞。

4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

單純?cè)谝浦参镏屑尤隻FGF也存在諸多問題，如移植術(shù)中術(shù)后的出血、滲出，會(huì)造成因子流失，而且由于外源性bFGF半衰期較短，易失活，擴(kuò)散快，對(duì)熱和酸非常敏感，易被蛋白酶分解，故需要大劑量或反復(fù)使用，才能維持其生物學(xué)效應(yīng)，并且價(jià)格昂貴[17]。如何才能將bFGF更好地應(yīng)用于脂肪組織工程中是一個(gè)急需解決的問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，為解決前述問題提供了可行的方法，展現(xiàn)出了廣闊的臨床應(yīng)用前景， Chang等[18]利用VEGF165 轉(zhuǎn)染的BMSCs更好地促進(jìn)了微血管的再生，加強(qiáng)了移植脂肪早期的血運(yùn)重建。所以，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將目的基因?qū)爰?xì)胞，可在分子水平改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，使目的基因在細(xì)胞持續(xù)高效表達(dá)，而且轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞合成分泌的內(nèi)源性生長因子經(jīng)過適當(dāng)?shù)胤g修飾過程，可識(shí)別更多的配體，能更加有效地和細(xì)胞表面受體結(jié)合[19]。因此，與外源性生長因子相比，其生物活性更高，降低大劑量或反復(fù)使用外源性生長因子的不良反應(yīng),更好地優(yōu)化種子細(xì)胞[20]。

目前，一般采用重組腺病毒或慢病毒等[21]作為載體介導(dǎo)bFGF的基因轉(zhuǎn)染。解燕春等[22]利用慢病毒載體介導(dǎo)bFGF基因，成功轉(zhuǎn)染 BMSCs后，其持續(xù)分泌bFGF，將其定向移植到大鼠腦梗死灶周圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梗死灶周圍微血管直徑、分支數(shù)目及面積，顯著高于未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。

總之，若將外源性bFGF基因?qū)胫窘M織工程的種子細(xì)胞，可使種子細(xì)胞高效持續(xù)表達(dá)bFGF，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖及定向分化，并促進(jìn)移植體的血管化，能取得良好的預(yù)期效果[23]。

5 緩釋技術(shù)的應(yīng)用

除了基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，緩釋技術(shù)也是解決bFGF在應(yīng)用時(shí)擴(kuò)散快、易降解、半衰期短等難題的理想方法。Khanna 等[24]利用多層海藻酸鈉微球持續(xù)釋放bFGF，在植入大鼠大網(wǎng)膜的模型中，CD31染色表明，載有600 ng的bFGF微球組刺激新生血管生成的密度，顯著高于空微球組，bFGF可產(chǎn)生快速和持續(xù)的血管生成反應(yīng)。靳元嶸和楊瑟飛[25]將bFGF稀釋成濃度為2 mg/L的生理鹽水溶液后，滴注葡聚糖顆粒，使之膨脹至停止，成為濕沙狀，制成bFGF-葡聚糖緩釋顆粒；再取大鼠腹股溝脂肪行自體脂肪移植，植入大鼠背部皮下，其中加入0.3 ml bFGF-葡聚糖緩釋顆粒的實(shí)驗(yàn)組包膜和移植體內(nèi)的血管計(jì)數(shù)，明顯高于加入0.3 ml生理鹽水葡聚糖顆粒對(duì)照組。

此外，bFGF具有與肝素結(jié)合的能力，肝素可穩(wěn)定其活性，使其免受熱、酸、蛋白水解酶的破壞。為促進(jìn)血管生成，生物支架可與肝素進(jìn)行交聯(lián)，再長時(shí)間浸入bFGF溶液中，令肝素充分吸附一定量的bFGF，利用復(fù)合生物支架對(duì)bFGF的結(jié)合和控釋能力，促進(jìn)脂肪組織工程的血管重建[26]。Lu等[27]利用該方法處理脂肪組織去細(xì)胞支架，植入小鼠體，利用脂肪組織ECM支架具備的自發(fā)成脂誘導(dǎo)環(huán)境，刺激小鼠體內(nèi)自發(fā)形成脂肪組織[28]，同時(shí)利用肝素對(duì)bFGF較強(qiáng)的結(jié)合和控釋能力，有效地誘導(dǎo)構(gòu)建的脂肪組織中新生血管形成。

6 結(jié)語

組織工程脂肪誘導(dǎo)血管生成不足，會(huì)限制干細(xì)胞的增殖分化，因此，要實(shí)現(xiàn)組織工程脂肪的血管化，必須要有促血管生成因子的存在。bFGF能趨化血管內(nèi)膜的各類細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖和遷移，明顯加強(qiáng)新生血管的形成，是理想的血管生成因子。不僅如此，bFGF還可促進(jìn)干細(xì)胞的分裂增殖，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的成脂化。通過多種技術(shù)將bFGF應(yīng)用于脂肪組織工程，利用其多樣的生物學(xué)特性，可提高干細(xì)胞生物學(xué)性能，并誘導(dǎo)其定向成脂分化，顯著提高工程化脂肪組織的血管化，使組織再生。相信，隨著人們對(duì)bFGF的不斷研究認(rèn)識(shí)，以及組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展提高，bFGF會(huì)在脂肪組織工程的構(gòu)建中發(fā)揮更加重要的作用。

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全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目 (BWS1IC061)

730030 甘肅 蘭州,蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(田亞菲)；蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 全軍燒傷整形外科中心(劉 毅)

田亞菲(1988-)，男，甘肅蘭州人，碩士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.017

2014-11-12)