蜉蝣過敏原皮膚點刺試驗、鼻黏膜激發(fā)試驗與嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗的對比

龍　綺，李春林，蔡篤程，劉　碩，謝偉偉，孟　光

(海口市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，?？?570208)

目前，過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)常用的診斷方法有血清特異性IgE檢測(specific IgE，sIgE)、皮膚點刺試驗(skin prick test，SPT)、血清吸入性過敏原過篩試驗(Phadiatop)等[1]。本研究分析海南省重要過敏原蜉蝣臨床皮膚點刺試驗陽性率，選擇SPT陽性患者進行鼻黏膜激發(fā)試驗，并觀察其陽性反應，另選擇蜉蝣過敏原SPT試驗陽性血液進行體外嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗，比較這3種方法結果是否相符。

對象和方法

對象

研究對象為2009年1月1日至2014年12月31日在?？谑腥嗣襻t(yī)院就診的AR患者，所有患者均有不同程度的鼻癢、打噴嚏、流鼻涕、鼻塞，部分有眼結膜充血、流淚等癥狀。AR診斷符合《過敏性鼻炎診療綱要2008》及我國AR指南的診斷標準[2-3]。行SPT前1周內(nèi)未使用抗組胺類藥物或糖皮質(zhì)激素。

方法

AR患者進行蜉蝣過敏原SPT。選擇30例蜉蝣過敏原SPT陽性(++)以上患者進行鼻黏膜激發(fā)試驗；30例蜉蝣過敏原SPT陰性健康志愿者為對照。另選30例蜉蝣過敏原SPT陽性(++)以上患者進行嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗；30例SPT陰性健康志愿者血液為對照。所有研究對象均符合醫(yī)學倫理學要求。

材料

皮膚試驗過敏原由北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。皮試液包括螨蟲、霉菌、花粉、蜉蝣、過敏原溶媒陰性對照液和組胺陽性對照液等20種。組胺檢測試劑盒由丹麥Feflab公司生產(chǎn)。

皮膚點刺試驗

方法：SPT參照文獻[4]方法進行?；颊呷∽?，手臂放松平放于桌面，用75%酒精消毒前臂掌側皮膚兩遍，再用蒸餾水將皮膚擦干凈。待皮膚自然晾干后，將18種過敏原點刺液及陽性對照液和陰性對照液按照2 cm的間隔縱向排列兩行滴在前臂，用點刺針的尖端垂直于皮膚，穿過點刺液，刺入皮內(nèi)，停留大約1 s，點刺后20 min觀察結果。

結果判斷：以過敏原與組胺陽性對照液所致風團面積對比確定其反應級別。以組胺陽性對照直徑為基準：(1)無風團、紅暈反應小于組胺陽性對照的1/3為陰性(-)；(2)風團為組胺陽性對照1/2，紅暈≤陽性對照者為(+)；(3)風團等于組胺陽性對照，紅暈>陽性對照者為(++)；(4)風團和紅暈均>陽性對照1倍者(+++)；(5)風團和紅暈>組胺陽性對照2倍以上，并有偽足者為(++++)。本研究以(+++)和(++++)統(tǒng)計強陽性率。

鼻黏膜激發(fā)試驗

參照文獻[5]方法，取1 cm邊長方形濾紙片，試驗組滴入1∶100蜉蝣過敏原皮試液1滴浸濕濾紙片，對照組滴入注射用水1滴。受試者取坐位，試驗前進行鼻部拍照，將濾紙片放入一側鼻腔下鼻甲前部外側面，鼻腔放入濾紙片后開始計時，一般觀察5～15 min。陽性反應癥狀表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、黏液鼻涕增加，以及眼癢、流淚等；嚴重者可誘發(fā)哮喘發(fā)作；體檢可發(fā)現(xiàn)鼻黏膜灰白水腫及分泌物增多。為預防哮喘發(fā)作，檢查現(xiàn)場應準備必需的急救藥物和設備。

嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗

血樣準備：采用患者檢測血清學IgE血樣，肝素抗凝靜脈血3 ml，離心(2 000 r/min)10 min，上清用于檢測總IgE，剩下部分加入上清等量稀釋液后混勻，取2 ml血樣和1 ml稀釋液分別加入包被有白細胞介素-3的試管中混勻，成為待檢血樣。陰性對照血樣按同樣方法準備。

過敏原提取液準備：取蜉蝣0.1 g，按1∶10比例加入試劑盒內(nèi)稀釋液，室溫震蕩提取30 min，離心取上清。按試劑盒操作說明將提取液按濃度梯度稀釋待用。在已包被了玻璃纖維檢測板的每孔中按稀釋梯度加入25 μl過敏原提取液，之后按操作說明每孔加入待檢血樣和對照血樣25 μl，置37℃溫箱孵育60 min，取出洗板；在每孔中加150 μl的SDS wash buffer，37℃孵育30 min后取出洗板；最后在每孔中加75 μl熒光劑，室溫下放置10 min，每孔中再加入75 μl終止液，檢測系統(tǒng)校準后上機檢測，通過測定熒光物質(zhì)熒光值來測定組胺的濃度。

結果判定：結果依據(jù)被檢過敏原激發(fā)患者嗜堿性粒細胞后產(chǎn)生組胺水平而判讀為陽性和陰性。

統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計蜉蝣過敏原SPT陽性率，嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗各組間陽性率采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

基線資料

共收集AR患者2 078例，年齡為5～65歲，平均(35.2±11.8)歲；男1 169例，女909例；發(fā)病時間為1～30年。進行鼻黏膜激發(fā)試驗的30例蜉蝣過敏原SPT陽性(++)以上患者年齡15～55歲，男13例，女17例，發(fā)病時間2～30年。30例SPT陰性健康志愿者年齡15～50歲，男14例，女16例。進行嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗的30例蜉蝣過敏原SPT陽性(++)以上患者年齡12～50歲，男12例，女18例，發(fā)病時間5～20年；30例SPT陰性健康志愿者年齡10～45歲，男14例，女16例。

蜉蝣過敏原皮膚點刺試驗結果

2078例AR患者蜉蝣過敏原SPT陰性者741例，陽性者1 337例，陽性率64.34%。其中(+)415例，(++)656例，(+++)227例，(++++)39例；(+++)和(++++)共266例，強陽性率為12.80%。

鼻黏膜激發(fā)試驗結果

30例SPT陽性患者均在3～5 min內(nèi)出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕、鼻塞，5例出現(xiàn)眼結膜充血、流淚等癥狀，未出現(xiàn)哮喘癥狀，陽性率為100.00%。30例陰性對照者在觀察的15 min內(nèi)均未出現(xiàn)陽性癥狀。

嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗結果

30例SPT陽性患者嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗陽性率為86.67%(26/30)，30例對照者嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗陽性率為6.25%(2/30)。2組陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.3，P<0.05)。

討　　論

AR主要由致敏物質(zhì)進入鼻腔，使鼻腔黏膜與相應的IgE結合而引起的一種過敏反應性疾病，屬IgE介導的Ⅰ型過敏反應，可引起多種并發(fā)癥。近10年來AR患病率明顯增加，大約影響到全球10%～25%的人群，尤其在工業(yè)發(fā)達的國家其患病率更高[6]。但在不同的地區(qū)，由于環(huán)境和物種的不同，引起AR的過敏原也存在較大差異。

蜉蝣目(Ephemeroptera)通稱蜉蝣，具有古老而特殊的性狀，是最原始的有翅昆蟲，主要分布在熱帶至溫帶的廣大地區(qū)。全世界已知有2 100余種，中國已知有100余種。常見的有蜉蝣科(Ephemeridae)和四節(jié)蜉蝣科(Baetidae)[4]。稚蟲水生，蜉蝣是魚類的重要餌料，成蟲不取食，存活期1～7 d，死后尸體風干碎屑隨風漂散于空氣中，可致呼吸道過敏。海南省是我國位于亞熱帶與熱帶地區(qū)的省份，雨量豐沛、河流湖泊等水域?qū)拸V且水質(zhì)優(yōu)良，為蜉蝣的生長繁殖提供了廣闊的空間，同時海南省也是漁業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖大省，所以海南地區(qū)居民吸入或者接觸到蜉蝣過敏原概率也較高[7]。

AR的診斷多以典型病史、鼻腔檢查及過敏原的檢測為主要依據(jù)，過敏原的檢測中SPT由Lewis和Grant在1926年首先描述。因其操作簡便、快速，且靈敏度、特異度以及重復性較好而被廣為應用，并逐漸成為最重要的診斷方法，SPT在臨床尤其是門診AR的初步診斷中更具有價值和意義[8]。鼻黏膜激發(fā)試驗是模擬自然發(fā)病條件，將可疑的過敏原或介質(zhì)直接放置于鼻腔黏膜，引起一系列的病理生理學反應，從而確定特異性過敏原的試驗。激發(fā)試驗是診斷過敏性疾病的“金標準”之一，但過敏原體內(nèi)激發(fā)試驗對患者的風險性大，合作性差，不易被接受[9]。另外，因國內(nèi)尚無統(tǒng)一的標準化過敏原，而國外產(chǎn)品進入我國品種單一，無地域性的特殊種類(如蜉蝣過敏原)，使體內(nèi)試驗受到嚴重限制。

體外血清學特異性IgE檢測是令致敏物質(zhì)與血清中的IgE結合，根據(jù)其濃度判斷是否對致敏物質(zhì)過敏，但是血清中其他原因產(chǎn)生的IgE(如寄生蟲等)也可被計算在內(nèi)而影響結果的準確性。嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗是用過敏原激發(fā)嗜堿性粒細胞，引起嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺，對組胺進行檢測，確定患者是否對該物質(zhì)過敏。嗜堿性粒細胞在國外已成為一種廣泛應用于臨床的體外過敏原檢測方法，主要用于診斷吸入性過敏原、食物過敏原、真菌、藥物及洗滌劑過敏[10-12]。為此，本研究選擇30例臨床蜉蝣過敏原SPT陽性的患者血液(去除血清)進行嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗，結果與SPT、鼻黏膜激發(fā)試驗結果比較，3種方法結果相符。特異性IgE檢測受過敏原品種的限制，有些當?shù)靥厥獾闹旅粑镔|(zhì)無法檢測，利用Histareader 501儀器及試劑盒，將其制備后放入試劑盒，檢測組胺釋放量，協(xié)助診斷，突破了皮膚點刺試驗及血清學sIgE檢測過敏原種類較少的限制，實現(xiàn)了對未經(jīng)純化或不能純化的抗原或不能應用于臨床的抗原進行檢測的目標。

綜上所述，蜉蝣過敏原的3種檢測方法結果相符。嗜堿性粒細胞激發(fā)實驗簡便、易行、準確性高，在體內(nèi)試驗遇到瓶頸的時期，不失為一種檢測地域性過敏原的好方法。

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