紫錐菊多糖對LPS損傷后IEC-6細胞的增殖作用

李艷云，張艷英，史秋梅，趙惠媛，王曉珊，盧會鵬 (河北科技師范學院，河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北昌黎 066600)

紫錐菊多糖對LPS損傷后IEC-6細胞的增殖作用

李艷云，張艷英，史秋梅*，趙惠媛，王曉珊，盧會鵬 (河北科技師范學院，河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室，河北昌黎 066600)

[目的]為了研究紫錐菊多糖對LPS損傷后小腸上皮細胞株IEC-6細胞增殖的影響。[方法]以IEC-6細胞為研究對象，將LPS 10 μg/ml分別與EPS 50、100、200、500 μg/ml先后加入培養(yǎng)液，采用MTT方法檢測細胞增殖率，觀察紫錐菊多糖對該細胞增殖的影響。[結果]紫錐菊多糖100、500 μg/ml對LPS損傷后的IEC-6細胞分別在48、72 h具有促增殖作用，因此紫錐菊多糖對LPS損傷后的IEC-6細胞具有保護作用。[結論]紫錐菊多糖預處理能增強LPS損傷后IEC-6細胞的增殖活性，能降低LPS對IEC-6細胞的損傷而顯現出對細胞的保護作用。

隱窩細胞；細胞增殖；脂多糖

紫錐菊(Echinaceapurpurea)是原產于美洲的一類菊科野生花卉，是世界聞名的“免疫”草藥[1]。紫錐菊含有紫錐菊甙、多糖、菊苣酸等多種活性成分[2]，能刺激巨噬細胞的吞噬功能，使T淋巴細胞增殖，顯著增強體液免疫功能，具有干擾素樣作用，抑制病毒生長[3]。LPS是革蘭氏陰性桿菌生長或死亡時裂解出來的細胞壁脂多糖成分，經腸道吸收進入血液循環(huán)后，導致體內細胞因子釋放的“級聯瀑布反應”引發(fā)多器官功能衰竭，甚至機體死亡[4-5]。小腸上皮隱窩細胞(IEC)在消化中不僅起吸收和交換營養(yǎng)的作用，而且是腸黏膜屏障的重要組成部分。它在宿主黏膜表面的天然及獲得性免疫系統中起調節(jié)作用，是對抗腸道細菌、毒素的第一道防線[6-8]。而小腸上皮細胞的增殖是腸道黏膜病理性損傷后修復，從而重建上皮完整性和維護黏膜屏障的關鍵[9-10]。

選擇大鼠小腸黏膜隱窩細胞株IEC-6為試驗對象，通過LPS作用于IEC-6細胞上造成體外炎癥性腸損傷模型，以觀察紫錐菊對IEC-6細胞的增殖作用為目標進行活性追蹤，從而明確紫錐菊對小腸黏膜修復的作用特點，闡明紫錐菊對腸黏膜修復作用的生物學機制，為藥物治療疾病提供現代藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 材料供試紫錐菊多糖EPS購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，多糖類質量分數大于94%；IEC-6細胞株購自上海拜力生物科技有限公司；細菌內毒素(LPS：E.ColiO55：B5，貨號L6529，Sigma產品)購于上海前塵生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)液DMEM，胎牛血清，胰島素，噻唑藍(MTT)：Sigma 公司產品；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購自美國Corning 公司。

完全培養(yǎng)液(cDMEM)由濃度90%DMEM、濃度10%進口胎牛血清、0.01 mg/ml胰島素組成；MTT溶液的制備方法為：取MTT 250 mg，37 ℃水浴中溶于50 ml 0.01 mmol/L pH 7.4的PBS中，濃度為5 mg/ml，過濾除菌分裝，凍存；LPS溶液的制備方法為：取LPS適量，分別用PBS稀釋至5、10、20 μg/ml，凍存；紫錐菊多糖溶液用蒸餾水稀釋至50、100、200、500 μg/ml，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1細胞的培養(yǎng)。IEC-6細胞株用濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，配以0.01 mg/ml胰島素，在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2細胞分組。將培養(yǎng)的細胞隨機分為六大組：A組空白對照組，以DMEM培養(yǎng)液為空白對照；B組單純LPS組，LPS濃度為10 μg/ml；C組單純EPS組，分為四亞組，即①EPS 50 μg/ml，②EPS 100 μg/ml，③EPS 200 μg/ml，④EPS 500 μg/ml；D組LPS與不同濃度EPS組，分為四亞組，即①LPS 10 μg/ml+EPS 50 μg/ml組，②LPS 10 μg/ml+EPS 100 μg/ml組，③ LPS 10 μg/ml+EPS 200 μg/ml組，④LPS 10 μg/ml+EPS 500 μg/ml組；E組EPS預處理與不同濃度LPS組，分為三亞組，即①EPS 500 μg/ml+LPS 5 μg/ml組，②EPS 500 μg/ml+LPS 10 μg/ml組，③ EPS 500 μg/ml+LPS 20 μg/ml組。每組試驗均重復3次。

1.2.3EPS對正常IEC-6細胞增殖的影響。取對數生長期細胞；用濃度0.25%胰酶加上濃度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min離心10 min，用DMEM懸浮細胞；用細胞記數板準確記數，以每孔1×104/200 μl密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，保證每孔細胞鋪滿孔底；24 h后取出培養(yǎng)物，加入不同濃度的EPS 100 μl，使其終濃度分別為50、100、200、500 μg/ml，空白對照組加入等量的DMEM；在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育24、48、72 h；培養(yǎng)時間結束后，從CO2培養(yǎng)箱中取出，加入MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h；1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入DMSO 150 μl，作用5 min，微振蕩，490 nm波長上測定每孔OD值；最后，計算細胞增殖率。

細胞增殖率=[1-(對照組OD-試驗組OD)/對照組OD]×100%

1.2.4EPS對LPS作用下IEC-6細胞增殖的影響。取對數生長期細胞；用濃度0.25%胰酶加上濃度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min離心10 min，用DMEM懸浮細胞；用細胞記數板準確記數，以每孔1×104/200 μl的密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，保證每孔細胞鋪滿孔底；24 h后取出培養(yǎng)物，加入10 μg/ml濃度的LPS 100 μl，繼續(xù)在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培育1 h；取出后，再加入不同濃度的EPS 100 μl，使其最終濃度分別為50、100、200、500 μg/ml，對照組加入等量的DMEM；在CO2培養(yǎng)箱中分別培育24、48、72 h；培養(yǎng)時間結束后，從CO2培養(yǎng)箱中取出，MTT處理方法步驟同“1.2.3”；最后，計算細胞增殖率。

1.2.5EPS預處理對LPS作用下IEC-6細胞增殖的影響。取對數生長期細胞；用濃度0.25%胰酶和濃度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min離心10 min，用DMEM懸浮細胞；用細胞記數板準確記數，以每孔1×104/200 μl密度接種于96孔微量培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，保證每孔細胞鋪滿孔底；24 h后取出培養(yǎng)物，加入500 μg/ml濃度的EPS100 μl預處理24 h；然后，給予LPS，使其終濃度分別為5、10、20 μg/ml，對照組加入等量的DMEM；在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培育1 h；培養(yǎng)時間結束后，從CO2培養(yǎng)箱中取出，MTT處理方法同步驟“1.2.3”；最后，計算細胞增殖率。

1.3 統計學分析所有數據以均值±標準差表示。用SPSS17.0統計軟件包進行單因素方差分析，以P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 正常及LPS損傷后小腸上皮細胞形態(tài)觀察正常小腸上皮細胞株由均勻的上皮樣細胞群體組成，呈鋪路石鑲嵌排列，互不重疊，為典型單層，細胞為不規(guī)則多角形，邊界清楚，細胞核較大，呈現卵圓形，細胞間相互連接，呈現旺盛的增殖性(圖1)。LPS損傷的小腸上皮細胞呈現細胞邊界模糊，細胞由多角形轉變?yōu)閳A形，細胞胞漿內出現大量顆粒樣物質，部分細胞膜破裂，細胞形態(tài)不完整(圖2～4)。

2.2 EPS對正常培養(yǎng)的IEC-6細胞增殖作用的影響EPS在不同時間段對正常培養(yǎng)的IEC-6細胞增殖作用不同。不同濃度的EPS對細胞的增殖作用有統計學意義上的差異。由表1、圖5可知，EPS對IEC-6細胞呈現劑量依賴性促增殖作用，但是隨著處理時間的延長，不同濃度的促增殖效果也不盡相同，表現為第24小時200 μg/ml EPS有顯著促增殖作用，而在第72小時EPS濃度為100 μg/ml時才表現出顯著的促增殖效應?？傮w來講，200 μg/ml濃度的EPS效果最佳，見表1、表2、圖5。

2.3 EPS對LPS損傷后IEC-6細胞增殖作用的影響IEC-6細胞受LPS(10 μg/ml)作用1 h后，在培養(yǎng)體系中加入不同濃度的EPS，觀察EPS對LPS損傷后IEC-6細胞是否仍有促增殖作用。由表2、圖6可知，受LPS作用的細胞，EPS濃度為50 μg/ml時作用24 h的效果最好，EPS濃度為100 μg/ml時作用48 h效果最好，而EPS濃度為500 μg/ml時作用在72 h達到最佳效果。

表1 EPS對正常培養(yǎng)的IEC-6細胞增殖活性的影響

表2 EPS對LPS作用下的IEC-6細胞增殖活性的影響

2.4 EPS預處理對LPS損傷的IEC-6細胞增殖作用的影響將培養(yǎng)的IEC-6細胞用500 μg/ml EPS預處理24 h，然后加不同濃度的LPS(分別為5、10、20 μg/ml)，觀察1 h，測定細胞增殖活性。由表3、圖7可知，EPS預處理后對LPS有顯著的促增殖作用。當受到5 μg/ml LPS作用時，與對照組相比，EPS預處理組沒有顯著的促增殖作用。但是，當受到10、20 μg/ml LPS作用時，與對照組相比，EPS預處理組有0.05水平顯著的促增殖作用。

表3 EPS預處理后LPS作用下的IEC-6細胞的增殖活性

3 結論與討論

小腸上皮隱窩細胞是腸道內重要的功能細胞，在免疫系統中起著重要的調節(jié)作用，并與腸道的內、外分泌功能有密切關系。腸道黏膜損傷后的修復主要依靠隱窩細胞的不斷增殖、分化，從而重建腸屏障功能。因此，研究腸上皮隱窩細胞的增殖對于修復腸黏膜損傷具有重要意義。研究表明，紫錐菊多糖對正常IEC-6細胞具有促進細胞增殖的作用。研究進一步顯示，對于受LPS損傷的小腸上皮細胞，當向培養(yǎng)體系中加入不同濃度的紫錐菊多糖時，在不同時間段、不同濃度均有促增殖作用。試驗還顯示，紫錐菊多糖預處理能增強LPS損傷后IEC-6細胞的增殖活性，能降低LPS對IEC-6細胞的損傷而顯現出對細胞的保護作用。這一作用在LPS 5 μg/ml小劑量時不明顯，而在劑量為10、20 μg/ml時有明顯的作用。這提示紫錐菊多糖的治療效果也取決于LPS對IEC-6細胞的損傷程度。小劑量LPS對腸道上皮的損傷較小，影響細胞的增殖功能不明顯，隨著LPS劑量的增大，對IEC-6細胞的損傷也增強，此時紫錐菊多糖的促增殖效果明顯顯現。試驗證明，紫錐菊多糖有促進腸黏膜上皮損傷修復的潛能。這從腸黏膜理化損傷修復角度說明預防性應用紫錐菊多糖在治療內毒素血癥引起的胃腸功能障礙中對減輕腸道損傷具有一定的應用價值

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The Multiplication Effect ofEchinaceapurpureaPolysaccharide on IEC-6 Cell after LPS Injury

LI Yan-yun, ZHANG Yan-ying, SHI Qiu-mei*et al

(Hebei Province Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Hebei Normal University of Science and Technology, Changli, Hebei 066600)

[Objective] To study effects ofEchinaceapurpureapolysaccharide on intestinal epithelial cell line IEC-6 cells multiplication after LPS damaged. [Method] To observe the effects ofEchinaceapurpureapolysaccharide on the cell multiplication, using IEC-6 cell as the research object, adding LPS 10 μg/ml into medium with EPS 50, 100, 200, 500 μg/ml, the rate of cell multiplication was detected by MTT method. [Result] The concentration ofEchinaceapurpureapolysaccharide at 100 and 500 μg/ml could promote proliferation on IEC-6 cells after LPS damaged in 48 and 72 h. So,Echinaceapurpureapolysaccharide had a protective effect on IEC-6 cells that LPS injured. [Conclusion]Echinaceapurpureapolysaccharide pretreatment can enhance the proliferation activity of IEC-6 cells and reduce the damage of IEC-6 cells after LPS injured, and show protective effect on cells.

Crypt cell; Cell multiplication; Lipopolysaccharide

國家自然基金項目(31472230)；河北省自然基金項目(C2014407068)；河北省科技支撐計劃(14966610D、12220408D)；石家莊市科技支撐計劃(131200063A)；河北省教育廳百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃(Ⅱ)、ZH2011244、Q2012037。

李艷云(1986- )，女，河南上蔡人，碩士研究生，研究方向：動物病原微生物與動物傳染病。*通訊作者，教授，從事動物傳染病學方面的研究。

2015-03-27

S 852.6

A

0517-6611(2015)14-019-03