抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS新分子標(biāo)記建立及23種香型水稻qSTV11KAS基因的調(diào)查分析

王英存，許言福，黃菊，王杰，李建粵

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS新分子標(biāo)記建立及23種香型水稻qSTV11KAS基因的調(diào)查分析

王英存，許言福，黃菊，王杰，李建粵

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

根據(jù)抗條紋葉枯病品種“秀水123”與易感品種“日本晴”抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS在距離起始密碼子第一個脫氧核苷酸+640處的差異，建立了一種能夠更便于區(qū)分qSTV11KAS基因型的CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記及檢測方法，并對23種香型水稻的qSTV11KAS基因進行調(diào)查分析.結(jié)果表明，CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記可以用來區(qū)別水稻是否含有抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS及基因型；在檢測的23種香稻中，僅有“中香1號”、“青香軟粳”和“泰國香稻”3種水稻含有與“秀水123”相同的qSTV11KAS抗性基因.本研究為今后分子標(biāo)記輔助選育抗條紋葉枯病香型水稻新品種和篩選條紋葉枯病新的抗性基因資源應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

分子標(biāo)記；抗條紋葉枯病基因；qSTV11KAS；CAPS(BtgⅠ)；香稻

0 引言

水稻是世界上食用人口最多、歷史最悠久的農(nóng)作物之一，全球25億以上的人主食大米.亞洲又是最主要的水稻生產(chǎn)與消費區(qū)，全世界90%以上的水稻產(chǎn)自亞洲.水稻條紋葉枯病是由灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallen，SBPH)傳播的水稻條紋病毒(Rice Stripe Virus，RSV)感染所致［1-2］.從2000年之后，水稻條紋葉枯病爆發(fā)更加嚴(yán)重，已經(jīng)造成長江中下游地區(qū)水稻產(chǎn)量的嚴(yán)重下降［3］，粳稻條紋葉枯病的發(fā)病率曾達到100%［4］，影響嚴(yán)重時，水稻產(chǎn)量下降40%～70%［5］.目前，控制水稻條紋葉枯病爆發(fā)最普遍的方法是使用農(nóng)藥殺蟲劑控制灰飛虱的傳播，但成本較高且污染環(huán)境.因此，培育抗條紋葉枯病的水稻品種，是防治條紋葉枯病最經(jīng)濟、安全、有效的措施.

Washio等［6］最早報道了兩個條紋葉枯病抗性基因.最近幾年中，水稻抗條紋葉枯病種質(zhì)資源的鑒定、抗性遺傳以及抗性品種的培育也取得了較大進展.Zhang等［7］定位了兩個抗條紋葉枯病QTLs：qSTV7和qSTV11KAS，它們分別位于水稻7號和11號染色體上.但在條紋葉枯病抗性基因研究領(lǐng)域，只有11號染色體的相應(yīng)區(qū)域檢測到了抗條紋葉枯病QTLs，即qSTV11KAS.qSTV11KAS定位在包括7個注釋基因的39.2 kb區(qū)域內(nèi)，其候選基因被認(rèn)為是LOC_Os11g30910［7］.

在過去的40年，來源于秈稻Modan的Stv-bi是品種選育中僅有的條紋葉枯病抗性基因資源［8-9］.然而，長期使用單個抗性基因?qū)?dǎo)致很多問題，如抗性的丟失和遺傳的脆弱性，因此，在水稻生產(chǎn)中，增加使用條紋葉枯病抗性基因或發(fā)展條紋葉枯病新抗性基因資源，將有可能避免條紋葉枯病的嚴(yán)重發(fā)生.

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)給水稻育種提供了新的途徑，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，可大大提高育種效率，縮短育種周期［10］.因此，加強分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在水稻育種上的應(yīng)用研究具有重要的實踐意義.

目前已經(jīng)開發(fā)了較多與Stv-bi位點篩選相關(guān)連鎖分子標(biāo)記［11-15］.本試驗是在許言福等［16］研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種能夠更易于判斷qSTV11KAS基因型的分子標(biāo)記及檢測方法，并利用建立的分子標(biāo)記對23種香型水稻品種的qSTV11KAS抗條紋葉枯病基因進行分析，以期為今后分子標(biāo)記輔助選育抗條紋葉枯病水稻新品種和發(fā)展條紋葉枯病新的抗性基因資源應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

許言福等［16］研究顯示，“秀水123”水稻與“Kasalath”水稻含有相同的qSTV11KAS抗性基因序列.本試驗使用3種類型的水稻材料.不含有qSTV11KAS基因的易感對照水稻品種：“日本晴”；含有qSTV11KAS基因的抗條紋葉枯病水稻品種：“秀水123”；23種待檢測的香型水稻品種：“大華香粳”、“蘇滬香粳”、“07-08香稻”、“南海138”、“云粳優(yōu)15”、“99983香稻”、“香粳05-7”、“武運2645”、“通運粳”、“紫香糯861”、“C香517”、“Della光身稻”、“中香1號”、“銀香28”、“寶大?！?、“W香99075”、“青香軟粳”、“滆湖香糯”、“香稻1號”、“銀香18”、“泰國香稻”、“武香14”、“大粒香”.

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻葉片總DNA的提取

取水稻新鮮幼嫩葉片，提取DNA.

1.2.2qSTV11KAS基因分子標(biāo)記PCR鑒定

PCR擴增試劑由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司提供.引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.PCR擴增反應(yīng)總體系為20 μL，其中無菌水14.8 μL，10×Buffer forTaqDNA Pol.(with Mg2+) 2 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)0.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，模板(DNA)0.5 μL，Taq酶0.2 μL(2.0U)，DMSO 1 μL.

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，32個循環(huán)；72℃最后延伸5 min.

對于qSTV11KAS基因擴增產(chǎn)物，需要進一步采用BtgⅠ限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切處理.酶切總體積50 μL，其中無菌水27 μL、10×NEBuffer 5 μL、PCR產(chǎn)物17 μL、BtgⅠ內(nèi)切酶(從BioLabs Inc公司購得)1 μL(10U).在37℃水浴中酶切6～7 h后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，電壓120 V，時間40 min.

2 結(jié)果與分析

2.1 建立抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS的CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記

比較“Kasalath”水稻與“日本晴”水稻qSTV11KAS基因編碼序列發(fā)現(xiàn)，兩者共有3處差異.在距離起始密碼子第一個脫氧核苷酸+150處，“Kasalath”水稻為T，“日本晴”水稻為G，但是編碼氨基酸種類沒有改變，都為脯氨酸；在距離起始密碼子第一個脫氧核苷酸+640處，“Kasalath”水稻為T，與其后兩個脫氧核苷酸一同編碼蘇氨酸，而“日本晴”水稻為A，相應(yīng)編碼的氨基酸為絲氨酸；在距離起始密碼子第一個脫氧核苷酸+670處開始，“Kasalath”水稻連續(xù)比“日本晴”水稻缺失6個堿基，導(dǎo)致兩個丙氨酸缺失.

“日本晴”水稻qSTV11KAS基因+640處的脫氧核苷酸為A，與其上游+638和+639脫氧核苷酸以及下游+641至+643脫氧核苷酸共同構(gòu)成了內(nèi)切酶BtgⅠ剪切識別序列：CCACGG(圖1).但是在“Kasalath”水稻相應(yīng)位點的脫氧核苷酸為T，從而在+638至+643位點處無法被BtgⅠ內(nèi)切酶酶切.由此設(shè)計一個能夠區(qū)別是否具有抗條紋葉枯病qSTV11KAS基因水稻的功能分子標(biāo)記CAPS(BtgⅠ).利用Primer Premier 5.0軟件，在qSTV11KAS基因+638至+643序列的兩端設(shè)計一對上、下游引物，序列分別為：5＇-ACTCACATCCCCTACTCCCT-3＇(F)和5＇-ATGCTGCATAGGTCGACGAT-3＇(R).

圖1 “Kasalath”水稻與“日本晴”水稻qSTV11KAS基因部分序列比較

以抗條紋葉枯病水稻品種“秀水123”作為抗性對照，易感品種“日本晴”作為非抗性對照，以及“秀水123”與“日本晴”雜交F1植株為雜合對照，利用本研究建立的CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記進行qSTV11KAS基因檢測.由于qSTV11KAS抗性基因在距離起始密碼子第一個脫氧核苷酸+670開始連續(xù)有6個脫氧核苷酸缺失，且擴增產(chǎn)物包含此差異位點，預(yù)計“秀水123”水稻PCR產(chǎn)物為446 bp，而“日本晴”水稻擴增產(chǎn)物為452bp.兩種水稻qSTV11KAS基因擴增產(chǎn)物經(jīng)BtgⅠ限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，“日本晴”水稻的擴增產(chǎn)物將被酶切為164 bp和284 bp(不包括酶切位點形成的粘性末端)兩條DNA片段，雜合植株具有3條帶.檢測結(jié)果與預(yù)期完全相符(圖2).檢測結(jié)果表明，CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記能夠明顯區(qū)分“秀水123”、“日本晴”以及雜合水稻qSTV11KAS基因的基因型.

圖2 3種對照水稻qSTV11KAS基因CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記檢測

2.2 23種常規(guī)香型水稻抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS的調(diào)查分析

利用抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS的CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記，對23個常規(guī)香型水稻抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS進行檢測.結(jié)果顯示，“中香1號”、“青香軟粳”和“泰國香稻”與“秀水123”擴增條帶一致，含有抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS；“大華香粳”、“蘇滬香粳”、“07-08香稻”、“南海138”、“云粳優(yōu)15”、“99983香稻”、“香粳05-7”、“武運2645”、“銀香28”、“寶大?！?、“通運粳”、“紫香糯861”、“C香517”、“Della光身稻”、“W香99075”、“滆湖香糯”、“香稻1號”、“銀香18”、“武香14”、“大粒香”與“日本晴”擴增條帶相同，不含有抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS(圖3).

圖3 23種常規(guī)香型水稻抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS檢測

3 討論

對基因開發(fā)分子標(biāo)記是采用分子標(biāo)記輔助選育水稻新品種操作的前提.在實際應(yīng)用中，對于一個好的分子標(biāo)記，易于檢測操作是非常重要的.但是，更為重要的是在對檢測結(jié)果進行判斷時，要求能夠非常容易識別出不同的基因型.

在我國江蘇和上海地區(qū)，前些年培育的抗條紋葉枯病水稻品種主要含有Stv-bi抗性基因.為了有可能使近幾年報道的水稻抗條紋葉枯病新基因qSTV11KAS［7］用于分子標(biāo)記輔助選育水稻新品種，需要對qSTV11KAS基因開發(fā)分子標(biāo)記并建立檢測方法.

許言福等［16］曾利用“Kasalath”水稻與“日本晴”水稻qSTV11KAS基因編碼序列缺失6個脫氧核苷酸差異的特性，首次建立了一個qSTV11KAS基因STS分子標(biāo)記.但是，由許言福等［16］建立的分子標(biāo)記，利用電泳檢測時要求配制難度較高的4%高濃度瓊脂糖凝膠，而且電泳時間較長，尤其是含有抗性及非抗性基因兩種水稻的PCR特異性擴增片段只相差6個脫氧核苷酸，在電泳后兩個差異片段之間有時較難分開，由此導(dǎo)致不同基因型判斷困難或錯誤.本研究根據(jù)抗病水稻品種與易感水稻品種qSTV11KAS基因在距離起始密碼子第一個脫氧核苷酸+640處脫氧核苷酸的差異，建立了CAPS(BtgⅠ)分子標(biāo)記及檢測方法，雖然需要增加一步對PCR產(chǎn)物的酶切操作，但對于檢測結(jié)果比許言福等［17］報道的方法，更易于識別qSTV11KAS不同的基因型，從而極大地提高了qSTV11KAS基因檢測的準(zhǔn)確性和實用性.

Yu等［4］利用田間自然誘發(fā)，對國內(nèi)外的119份地方水稻品種資源進行條紋葉枯病抗性鑒定.結(jié)果顯示，在119份供試材料中，56份秈稻材料中55份抗水稻條紋葉枯病；63份粳稻材料中，只有2份粳稻抗條紋葉枯病，其余61份都不抗水稻條紋葉枯病.在本試驗使用的23份香型水稻品種中，“紫香糯861”、“Della光身稻”和“中香1號”屬于秈稻品種.qSTV11KAS基因分子標(biāo)記檢測顯示，“Della光身稻”和“中香1號”含有抗條紋葉枯病基因.本試驗使用的另外20種香稻都屬于粳稻，其中僅有“青香軟粳”一個水稻品種含有qSTV11KAS抗性基因.由此說明，在中國江蘇和上海地區(qū)的水稻中，不論是一般的粳稻還是香型粳稻，能夠抗條紋葉枯病品種占的比例還較低.在中國江蘇和上海地區(qū)都應(yīng)該加強抗條紋葉枯病粳型水稻新品種的選育.

香味被認(rèn)為是最有價值的水稻品質(zhì)性狀之一.香米因其獨特的香味，在國際稻米市場上占有重要地位，價格是一般稻米的2～3倍.香稻不僅在亞洲得到一致好評，而且在歐洲、澳大利亞、美國和中東都得到廣泛的認(rèn)可［17-20］.目前國際市場的香米主要來自于印度和泰國，在中國也應(yīng)該重視培育具有優(yōu)良性狀的香稻品種.在本研究鑒定的23種香稻品種中，雖然有少量香稻含有抗條紋葉枯病基因qSTV11KAS，但大部分香稻品種不含有qSTV11KAS基因.本試驗建立的qSTV11KAS抗性基因分子標(biāo)記，也可被用于水稻優(yōu)良品質(zhì)性狀分子標(biāo)記輔助育種的研究中.

明確親本基因組成是利用分子標(biāo)記輔助選擇育種的前提.本實驗室徐小龍等［21］和黃菊等［22］分別收集了24個香稻品種和23個香稻品種，分別對它們的香味基因和10個涉及食味品質(zhì)基因的基因型進行了分析，為今后利用這些香稻作為親本進行水稻新品種選育研究提供了重要的香味基因型和食味品質(zhì)基因的信息.本研究使用的23種香稻有較多都與徐小龍等和黃菊等的報道相同.因此，結(jié)合徐小龍等、黃菊等以及本研究報道，可為今后培育抗條紋葉枯病優(yōu)質(zhì)的香稻新品種提供香味基因、食味品質(zhì)基因以及抗條紋葉枯病基因3個方面的重要信息.

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Establishment of a new molecular marker for identifying rice stripe virus-resistant gene qSTV11KASand investigation of the gene in 23 fragrant rice cultivars

WANG Yingcun，XU Yanfu，HUANG Ju，WANG Jie，LI Jianyue
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

A functional molecular marker CAPS(BtgⅠ)to identify rice stripe virus-resistant geneqSTV11KAShas been developed according to the DNA sequence difference at the+640 site from the first deoxynucleotide of the start codon in theqSTV11KASgene between″Xiushui 123″，which is stripe virus-resistant rice cultivar，and″Nipponbare″，which is stripe virus-susceptible rice cultivar.Using the functional molecular marker CAPS(BtgⅠ)，genotypes of theqSTV11KASgene in the 23 fragrant rice cultivars were analyzed.The results showed that the functional molecular marker CAPS(BtgⅠ)can be used to distinguish two kinds ofqSTV11KASgene and their genotypes.In the 23 fragrant rice cultivars，only three cultivers namely the″Zhongxiang No.1″，″Qingxiangruanjing″and″Thai fragrant rice″，containqSTV11KASresistant gene，which are the same to″Xiushui 123″.This study laid an foundation for molecular marker-assisted breeding for new rice stripe virus-resislant fragrant rice cultivars and for development and application of rice stripe virus-resistant gene resource.

molecular markers；rice stripe virus-resistant gene；qSTV11KAS；CAPS(BtgⅠ)；fragrant rice

Q 341

A

1000-5137(2015)06-0657-06

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.013

(責(zé)任編輯：顧浩然，包震宇)

2015-10-01

上海市農(nóng)委“水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)”專項資助

李建粵，中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，郵編：200234，E-mail：lijianyue01@aliyun.com