栽培基質(zhì)和營養(yǎng)液濃度對白發(fā)蘚生長影響的研究

丁雪，郭水良，婁玉霞

(上海師范大學生命與環(huán)境科學學院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

栽培基質(zhì)和營養(yǎng)液濃度對白發(fā)蘚生長影響的研究

丁雪，郭水良，婁玉霞

(上海師范大學生命與環(huán)境科學學院植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海200234)

通過對白發(fā)蘚生長最佳基質(zhì)和營養(yǎng)液的篩選，來大量純種擴繁白發(fā)蘚.通過組織培養(yǎng)得到了白發(fā)蘚(Leucobryumglaucum)的無菌配子體，將它們接種于裝有泥炭土、蛭石和珍珠巖不同基質(zhì)比例的培養(yǎng)瓶內(nèi)，并加入不同濃度的knop＇s營養(yǎng)液，通過60 d的培養(yǎng)，測定了不同處理的白發(fā)蘚配子體的葉綠素含量，配子體長度、總鮮重和分枝數(shù)等指標.發(fā)現(xiàn)泥炭土∶蛭石∶珍珠巖2∶2∶1比例、20%濃度的Knop＇s營養(yǎng)液有利于白發(fā)蘚配子體的生長.

白發(fā)蘚；離體培養(yǎng)；泥炭土；營養(yǎng)液

0 引言

苔蘚植物屬最原始的高等植物，但是它們種類豐富，數(shù)量上僅次于被子植物.苔蘚植物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在水土保持，維持生態(tài)系統(tǒng)、對環(huán)境指示作用，以及次生代謝物質(zhì)的積累等方面有其獨到之處，相當一部分種類具有很高的觀賞價值，在中國傳統(tǒng)盆景中被大量應用［12］.

白發(fā)蘚(Leucobryum glaucum)是白發(fā)蘚科植物，莖高20 cm，多分枝.中肋橫切面中間呈現(xiàn)1行綠色細胞，兩邊各具2層大形無色細胞.雌雄異株.蒴柄纖細，長2～3 cm，紅褐色；孢蒴圓錐形，弓形彎曲.多見于中國長江流域以南山區(qū)的濕潤林地，亞洲東南部亦有.由于其葉片多為大型無色透明細胞所組成，能含蓄其自身重量數(shù)倍至十多倍重量，為苗木運輸良好的包裹材料.本文作者通過組織培養(yǎng)獲得了白發(fā)蘚的配子體材料，再將之移栽至自然栽培基質(zhì)條件下，通過研究，了解影響組培苗生長的環(huán)境因素，對白發(fā)蘚大量純種擴繁有重要意義，也為白發(fā)蘚的盆景園藝應用提供大量繁育的技術(shù)方法.

1 材料與方法

1.1 材料

將野外獲得的白發(fā)蘚配子體，用75%乙醇消毒滅菌，接種至knop＇s培養(yǎng)基中，篩選出無菌的配子體，將無菌配子體轉(zhuǎn)接至至knop＇s培養(yǎng)基中擴繁.取組培條件下無菌白發(fā)蘚單個配子體枝條，長度約為10 mm.

1.2 方法

設立19個不同培養(yǎng)基質(zhì)組成和營養(yǎng)液濃度的實驗方案(表1).實驗時將泥炭土，蛭石和珍珠巖按設定的比例裝入培養(yǎng)瓶(ZP16-340廣口瓶)內(nèi)，每瓶基質(zhì)總體積為150 mL，標號備用.

分別配制100%、20%、10%濃度的改良konp＇s營養(yǎng)液各1 L，每個濃度的knop培養(yǎng)液分別加入蔗糖，濃度為10 g/L，備用.

表1 27個實驗處理方案

1.3 滅菌

將配制好的3種營養(yǎng)液分別加入裝有不同基質(zhì)的培養(yǎng)瓶中，每瓶依據(jù)各基質(zhì)的飽和吸水量的60%加入適量營養(yǎng)液.將上述裝有不同基質(zhì)和營養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶密封，標號，放入滅菌鍋滅菌，利用高溫濕熱的蒸汽(121℃以上)消毒處理20 min.

1.4 接種

在無菌環(huán)境下，將無菌的組培苗(配子體)接種至滅好菌的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種6株，配子體長度10 mm左右，密封.每種處理設置3個重復.培養(yǎng)溫度(23±2)℃，光照強度27 μmol·m-2·s-1，光照時間12 h/d，空氣相對濕度70%～80%，培養(yǎng)60 d.

2 指標測定

2.1 生物量及形態(tài)指標的測定

用攝子依次取出培養(yǎng)瓶中的6株白發(fā)蘚植株(配子體)，用蒸餾水洗凈，用吸水紙吸干表面水分，分別用電子游標卡尺測定從尖部到基部的長度，獲得瓶中6株白發(fā)蘚的配子體平均長度.記錄除了接種的配子體苗外新生配子體數(shù)以及新生分枝數(shù)，并稱量其鮮重.

2.2 葉綠素的含量測定

將2.1取出的6株白發(fā)蘚稱量鮮重后剪碎并混合均勻，稱取0.1 g白發(fā)蘚樣品測定其葉綠素含量(鄒綺，2000).

2.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設置3次重復，圖表中數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤表示，將數(shù)據(jù)最大的一組處理作為比較對象，采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件中的One-wayANOVA比較其他處理結(jié)果與該組結(jié)果的差異性；并應用雙因素方差分析檢測培養(yǎng)基、營養(yǎng)液和兩因素是否存在交互作用.

在實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)蘚重、葉綠素量、分枝數(shù)和配子體長度指標計算27種處理組合對白發(fā)蘚配子體生長的生長指數(shù).

式中，vij指第i個組合第j個指標值，m=27，n為指標，n=4，Gi表示某種處理組合i的生長指數(shù)，該值在0～1之間.

3 結(jié)果

3.1 基質(zhì)和營養(yǎng)液對白發(fā)蘚鮮重指標的影響

經(jīng)過60 d培養(yǎng)后27個處理白發(fā)蘚的鮮重見圖1.從圖1可以看出，處理20號(泥炭土和蛭石為1∶1，20%knop營養(yǎng)液)的平均鮮重最高，為0.38 g，其次為5、2、8、25、26這五個處理，其鮮重分別為0.35、0.35、0.34、0.33和0.32 g，后面五個處理對白發(fā)蘚鮮重的影響與第20號處理的沒有明顯區(qū)別，盡管平均值上存在一定的差異.這些處理的共同特點是Knop營養(yǎng)液濃度除了25號處理為1外，其余的五個均為0.2.

在27個處理組合中，鮮重由高到低排列，前17個處理中，除了25號處理的營養(yǎng)液濃度為100%外，其余的均為10%或20%.反過來，鮮重小的的后面7個處理的knop營養(yǎng)液的濃度均為100%，反映出相對低濃度的Knop營養(yǎng)液有利于白發(fā)蘚配子體的生長.

在培養(yǎng)基組成相同的9個處理組合中，除了25、26和27培養(yǎng)基組合在knop濃度為1時白發(fā)蘚鮮重最高外，其余的7個組合處理均表現(xiàn)出在knop培養(yǎng)液濃度為20%時最高，1個組合在knop培養(yǎng)液濃度為10%時最高，不過與濃度為20%時的差異不大.不考慮培養(yǎng)基的組成，如果以knop培養(yǎng)液濃度來分析，10%、20%和100%濃度時的處理白發(fā)蘚的平均鮮重分別為0.2648、0.3122 g，和0.2067 g.很明顯，20%knop培養(yǎng)液最有利于白發(fā)蘚鮮重增加.

雙因素方差發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)液和培養(yǎng)基均會對白發(fā)蘚的鮮重產(chǎn)生顯著影響，而且兩者之間存在顯著的互作效應(表2).

表2 營養(yǎng)液和培養(yǎng)基對白發(fā)蘚鮮重的效應統(tǒng)計檢驗

在培養(yǎng)液濃度最理想的20%各組合中，又以泥炭土和蛭石分別為1∶1的比例下白發(fā)蘚的鮮重最高(20號處理)，為0.377 g，其次是泥炭土和珍珠巖分別為2∶1的處理(即5號處理)，0.35 g.

雙因素方差分析表明，營養(yǎng)液和培養(yǎng)基對白發(fā)蘚鮮重均存在極顯著的影響，而且這兩因素對鮮重也存在極顯著的互作效應.

3.2 基質(zhì)和營養(yǎng)液對白發(fā)蘚配子體長度指標的影響

27個處理，經(jīng)過60 d培養(yǎng)后白發(fā)蘚配子體長度見圖2.從圖2可以看出，處理6的平均配子體長度最高，為21.86 mm，其次為18、12、8、3、20、21、9，這7個處理，其配子體長度分別為21.32、21.18、20.92、20.70、20.67、20.53和20.52 mm.后面7個處理的配子體長度與第6號處理的沒有明顯區(qū)別.這些處理的共同特點是Knop營養(yǎng)液濃度除了8號和20號處理為20%外，其余的5個均為10%.就配子體長度來分析，以泥炭土和珍珠巖比例為2∶1，knop營養(yǎng)液濃度為10%的組合效果最好.

圖2 不同處理對白發(fā)蘚配子體長度影響(圖中不同字母表示處理與第6號處理的結(jié)果有顯著差異，df=80，MSE=61.432，F(xiàn)=9.613，P＜0.001)

在27個處理組合中，配子體長度由高到低排列，前19個處理中，除了25號處理的營養(yǎng)液濃度為100%外，其余的均為10%或20%.反過來，配子體長度小的的后面8個處理的knop營養(yǎng)液的濃度均為100%，反映出高濃度的培養(yǎng)液不利于培養(yǎng)過程中白發(fā)蘚的配子體長度的增加.

在培養(yǎng)基組成相同情況下(9個培養(yǎng)基組合)，有5個組合處理均表現(xiàn)出在knop濃度為10%時白發(fā)蘚配子體最長，其他4個組合在20%時最高，不過與濃度10%時的差異不大.不考慮培養(yǎng)基的組成，如果以knop培養(yǎng)液濃度來分析，10%、20%和100%濃度時的處理白發(fā)蘚的平均配子體長度分別為20.4210、19.9944和16.8619 mm.從上可以看出，10%knop培養(yǎng)液最有利于白發(fā)蘚配子體長度增加.

雙因素方差發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)液會對白發(fā)蘚的配子體長度產(chǎn)生顯著影響，但是培養(yǎng)基種類不同對白發(fā)蘚配子體長度影響不大，不過兩者之間卻存在顯著互作效應(表3).

表3 營養(yǎng)液和培養(yǎng)基對白發(fā)蘚配子體長度的效應統(tǒng)計檢驗

3.3 基質(zhì)和營養(yǎng)液對白發(fā)蘚分枝數(shù)指標的影響

經(jīng)過60 d培養(yǎng)后不同處理組合下白發(fā)蘚分枝數(shù)見圖3.從圖3可以看出，處理26的平均分枝數(shù)最多，為4.5，其次為8、12、6、23、27、11、14、3、20、17、16、5這12個處理，其分枝數(shù)從3.17到4.0不等，不過統(tǒng)計上與處理26沒有顯著差異.這些處理的共同特點是Knop營養(yǎng)液濃度除了16號處理為100%外，其余營養(yǎng)液濃度均為20%或10%.就分枝數(shù)來分析，以泥炭土和蛭石比例為1∶3，knop營養(yǎng)液濃度為20%的組合效果最好.

圖3 不同處理對白發(fā)蘚分枝數(shù)的影響(圖中不同字母表示處理與第26號處理的結(jié)果有顯著差異，df=80，MSE=38.298，F(xiàn)=2.470，P＜0.001)

雙因素方差發(fā)現(xiàn)，不同濃度的knop營養(yǎng)液對白發(fā)蘚的分枝數(shù)產(chǎn)生顯著影響，而培養(yǎng)基種類對其影響不大，而且培養(yǎng)基和培養(yǎng)液之間也沒有互作效應(表4).

表4 營養(yǎng)液和培養(yǎng)基對白發(fā)蘚分枝數(shù)的效應統(tǒng)計檢驗

在培養(yǎng)液濃度最理想的20%各組合中，又以泥炭土和蛭石比例為1∶3下白發(fā)蘚的分枝數(shù)最多(26號處理)，為4.5，其次是泥炭土∶珍珠巖∶蛭石=2∶2∶1的處理(即8號處理)，分枝數(shù)為4.

雙因素方差分析表明，營養(yǎng)液對白發(fā)蘚分枝數(shù)存在極顯著的影響，而且這兩因素對分枝數(shù)不存在極顯著的互作效應.

3.4 基質(zhì)和營養(yǎng)液對白發(fā)蘚葉綠素含量指標的影響

27個處理，經(jīng)過60 d培養(yǎng)后白發(fā)蘚的葉綠素含量見圖4.從圖4可以看出，處理14的平均葉綠素含量最高，為1.21 mg/g，其次為16、13、5、18、17、3、11這7個處理，其葉綠素含量從0.956～1.1443 mg/g不等，它們與第14號處理的沒有明顯區(qū)別.除13、16號的knop營養(yǎng)液濃度為1外，其余的6個為10%或20%.就葉綠素含量來分析，以泥炭土和蛭石比例為4∶1，knop營養(yǎng)液濃度為20%的組合效果最好.

圖4 不同處理對白發(fā)蘚葉綠素含量的影響(圖中不同字母表示處理與第14號處理的結(jié)果有顯著差異，df=80，MSE=1.332，F(xiàn)=1.892，P=0.024)

雙因素方差發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)液和培養(yǎng)基均會對白發(fā)蘚的葉綠素含量產(chǎn)生顯著影響，而且兩者之間存在顯著的互作效應(表5).

雙因素方差分析表明，培養(yǎng)基對白發(fā)蘚葉綠素含量存在極顯著的影響，營養(yǎng)液對白發(fā)蘚葉綠素含量存在較顯著的影響，而且這兩因素對葉綠素含量不存在極顯著的互作效應.

表5 營養(yǎng)液和培養(yǎng)基對白發(fā)蘚葉綠素含量的效應統(tǒng)計檢驗

圖5 基于鮮重等4個指標的不同處理對白發(fā)蘚生長影響綜合指標

綜合指數(shù)見圖5.可以看出，處理8的綜合指數(shù)最高，其培養(yǎng)基的組合為泥炭土∶蛭石∶珍珠巖2∶2∶1比例、20%濃度的Knop＇s營養(yǎng)液，其次是26、12、6、20.即10%～20%濃度knop培養(yǎng)液，基質(zhì)中有較高比例的泥炭土，并有一定比例的珍珠巖或蛭石的培養(yǎng)基中，白發(fā)蘚有良好的生長表現(xiàn).

4 討論

不同苔蘚植物對培養(yǎng)基質(zhì)的要求是不同的，尋找苔蘚植物的合適培養(yǎng)基成為苔蘚植物組織培養(yǎng)和栽培研究的重點.姜山和田學武(2012)［2］研究發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基上采用稀釋2倍的Knop培養(yǎng)基培養(yǎng)銀葉真蘚和泥炭蘚配子體效果最好.王振杰等(2008)［4］研究了Knop，SH(Schenk和Hildebrandt)和N6培養(yǎng)基對金灰蘚(Pylaisiellapolyantha)孢子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)Knop培養(yǎng)基上孢子萌發(fā)率最高；于傳梅等(2007)［10］使用Knop、Benek及MS培養(yǎng)基，對5種苔蘚植物進行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)簡單的Knop和Beneck培養(yǎng)基能促進短月蘚(Brachymenium nepalense)孢子萌發(fā)，并能夠在50d左右生長出莖葉體，而復雜的MS和1/2 MS培養(yǎng)基使萌發(fā)的孢子發(fā)生褐變.吳躍開等(2000)［5］對匐燈蘚(Plagiomnium acutum)的研究表明，不同基質(zhì)上濕地蘚的生長效果和生長發(fā)育狀況存在顯著差異，其中以含灰分高的基質(zhì)生長量最大.于梅娟等(2013)［6］研究發(fā)現(xiàn)，在MS、改良的Knop、改良的Beneck培養(yǎng)基上，配子體接種到有機培養(yǎng)基MS上染菌率低，生長狀況較好.梁紅柱等(2010)［3］發(fā)現(xiàn)，對于大葉蘚(Rhodobryum roseum)來講，BG11培養(yǎng)基最適于大葉蘚原絲體的萌發(fā)和愈傷組織的生成，，其他適于大葉蘚組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基依次為Knop、改良Knop、BBM、1/2 MS和MS.另外，梁書豐(2010)［9］研究發(fā)現(xiàn)，在Knop液體培養(yǎng)基中添加入0.1 μmol GA3和20 g/L葡萄糖后，經(jīng)過60 d的生長，多枝青鮮干重約為對照的21倍，組培材料移栽到草炭土，蛙石和園土后，均可繁殖.其中以草炭土中繁殖量最多，繁殖面積最大.

嘗在實驗設計方面，正交設計法可用最少的處理組合數(shù)研究較多的實驗因素，已在農(nóng)業(yè)研究中廣泛應用.玄雪梅等(2004)［7］應用正交設計法比較了田土、河沙、蛭石、珍珠巖、石英砂，以及Hoagland，Knop，1/10 MS和水4種培養(yǎng)液組合對刺葉墻蘚繁殖的影響，發(fā)現(xiàn)田土和砂再加營養(yǎng)土的基質(zhì)上刺葉墻蘚生長最佳，其次是蛭石和珍珠巖.石英砂的保水性能欠佳，致使營養(yǎng)液與植物體不能充分接觸，而不能提供足夠的生活養(yǎng)分.

本項工作應用了組織培養(yǎng)產(chǎn)生的無菌配子體材料，開展栽培基質(zhì)和營養(yǎng)液濃度對白發(fā)蘚配子體生長影響的研究，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)液的濃度過高會在一定程度上抑制白發(fā)蘚配子體的生長，濃度過低的營養(yǎng)液不能給白發(fā)蘚的配子體生長提供足夠的養(yǎng)分，稀釋5倍的改良konp＇s營養(yǎng)液最有利于白發(fā)蘚的生長.全部都是泥炭土的基質(zhì)孔隙度小，不利于白發(fā)蘚的呼吸及生長，泥炭土和珍珠巖混合的基質(zhì)，由于未添加蛭石，基質(zhì)的保水性能不高，除了6號外，也不利于白發(fā)蘚的生長，實驗中所得泥炭土和蛭石的比例，既具有良好的保水性，又可以給白發(fā)蘚提供部分所需的養(yǎng)分，并且不會阻礙白發(fā)蘚配子體的呼吸生長，這樣的基質(zhì)配方更有利于白發(fā)蘚配子體的生長.

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On influences of cultivated media and nutrient concentrations on growth of leucobryum glaucum

DING Xue，GUO Shuiliang，LOU Yuxia
(Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)

Screening by Leucobryum glaucum growth optimal substrate and nutrient solution，to a large number of purebred breeding leucobryum.The flask culture conditions of the gametophyte ofLeucobryum glaucuminoculated with peat，vermiculite and perlite matrix at different proportions，and adding knop＇s nutrition liquid at different concentrations.After a 60-day cultivation，the chlorophyll content，length，total fresh weight and branch number of the gametophytes ofL.glaucumwere measured.The results showed thatL.glaucumcould grow well on the medium with a proportion of peat，vermiculite and perlite at 2∶2∶1，together with 20%Knop＇s nutrition liquid.

glaucum；invitro；peat；nutrition

S 792.11

A

1000-5137(2015)06-0612-07

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.06.006

(責任編輯：顧浩然，郁慧)

2014-10-08

上海市科委(11391901200，12490502700)；上海市高校知識服務平臺-上海市植物種質(zhì)資源中心經(jīng)費.

婁玉霞，中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號，上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，郵編：200234，E-mail：yuxialou@shnu.edu.cn