新疆不同產(chǎn)地石榴皮品種優(yōu)選

常占瑛，劉桂花，陳雪珊，高曉黎，古麗巴哈爾·卡吾力＊（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 8300；.新疆藥物研究所，烏魯木齊 830004）

新疆不同產(chǎn)地石榴皮品種優(yōu)選

常占瑛1，劉桂花2，陳雪珊1，高曉黎1，古麗巴哈爾·卡吾力1＊（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆藥物研究所，烏魯木齊 830004）

目的 通過綜合評(píng)分篩選出最優(yōu)石榴皮品種。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定沒食子酸、鞣花酸含量；紫外分光光度法測(cè)定總多酚含量。結(jié)果 沒食子酸在10.88～348μg·mL－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r＝0.999 8），鞣花酸在9.94～318μg·mL－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r＝0.999 9），沒食子酸在1.1～7.7μg·mL－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r＝0.999 9）。結(jié)論 通過綜合評(píng)分篩選出喀什市酸石榴皮為最優(yōu)品種。

石榴皮；沒食子酸；鞣花酸；總多酚

石榴（Punica granatumL.）為石榴科石榴屬植物，是一種藥食同源的植物資源，石榴的汁、果皮、花、葉、籽、根皆可入藥，具有抗氧化、清除自由基、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒、抗癌及改善婦女更年期綜合征等多種生理和藥理活性［1］。石榴皮含有多酚、黃酮、氨基酸、微量元素等多種化學(xué)成分，1995年版《中國(guó)藥典》開始規(guī)定石榴皮主要成分鞣質(zhì)的量不得低于10%。鞣質(zhì)（tannins）又稱單寧，是存在于綠茶、葡萄、藍(lán)莓和石榴等植物中的一類多元酚類化合物，但石榴多酚比茶多酚、葡萄多酚等的抗氧化性、抗菌活性和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用更顯著［2］。石榴多酚主要存在于石榴果皮中，約為其干質(zhì)量的10.4%～21.3%，石榴皮多酚主要成分包括安石榴苷（punicalagin）、鞣花酸、石榴皮鞣素和沒食子酸等，據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道［3－5］，沒食子酸具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、殺蟲等多種功效。鞣花酸能與金屬離子螯合，并能與自由基反應(yīng)，從而具有抗氧化功能［6］，鞣花酸同時(shí)還可以抗肺癌、食管癌［7］。藥理實(shí)驗(yàn)也表明，石榴皮具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用。因此測(cè)定石榴皮中總多酚、沒食子酸、鞣花酸的含量，可以從一定程度上反映其內(nèi)在質(zhì)量。新疆氣候干燥，夏季酷熱，降水稀少，非常適宜種植石榴，但該地區(qū)石榴品種較多，地區(qū)與地區(qū)之間的差異較大，篩選出較優(yōu)產(chǎn)地的石榴皮品種可以為以后的科學(xué)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV－2550PC可見－紫外分光光度計(jì)（島津制作所）；Sartorius BS110S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EYELA N－1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科教儀器有限公司）；LC－10ATVP高效液相色譜儀（日本島津）、SPD－10AVP檢測(cè)器。

1.2 試藥 沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110831－200302，中國(guó)藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）；鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)為110831－200302，中國(guó)藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）；甲醇為色譜純；水為雙蒸水；磷酸、乙醚均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 石榴皮中沒食子酸的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB－C18（250mm ×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：2mL·L－1磷酸－甲醇（97∶3）；流速：0.8mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：273nm；柱溫30℃［810］；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，沒食子酸與供試品中其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，分離度大于1.5，保留時(shí)間適中。對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品8.7mg，置于25mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻。制成每1mL含沒食子酸0.348mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，依次稀釋，得不同系列質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL進(jìn)樣，以峰面積Y、沒食子酸含量X進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝69 602 X＋6 733.1，r＝0.999 8（n＝6），沒食子酸在10.88～348μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地石榴皮粉末約20g，加HCl（1→9）250mL，乙醚250mL，回流水解2.0h，過濾，提取2次，合并濾液，蒸干，甲醇溶解，定容至100mL，搖勻，吸取1mL稀釋至50mL，用微孔濾膜（0.45μm）過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日內(nèi)、日間標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果表明，日內(nèi)及日間標(biāo)準(zhǔn)差均小于2%，說明本法比較穩(wěn)定，重復(fù)性好。

2.1.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定5份樣品，按2.1.4項(xiàng)方法制成供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定沒食子酸含量，平均含量為2.41mg·g－1，RSD為1.77%，表明本方法重復(fù)性符合分析要求。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，24，36和48h進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積計(jì)算，考察其48h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為1.37%，表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品細(xì)粉適量，加入定量的沒食子酸對(duì)照品溶液，按2.1.4項(xiàng)方法制備溶液和測(cè)定，計(jì)算回收率，9次測(cè)得沒食子酸平均回收率為100.39%，RSD為1.19%，表明分析方法準(zhǔn)確，見表l。

表1 沒食子酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The results of recovery tests of gallic acid （n＝9）

2.2 石榴皮中鞣花酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB－C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－乙酸乙酯－磷酸二氫鉀／磷酸（0.05mol·L－1）（32∶2∶66）；流速：1 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm［11］；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，鞣花酸與供試品中其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，分離度大于1.5，保留時(shí)間適中。對(duì)照品和供試品的色譜圖見圖1。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對(duì)照品15.9mg，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。制成每1mL含鞣花酸0.318mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取鞣花酸對(duì)照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，依次稀釋，得不同系列質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL進(jìn)樣，以峰面積Y、鞣花酸含量X進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝6 047.5 X＋7 516.3，r＝0.999 9（n＝6），鞣花酸質(zhì)量濃度在9.94～318μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱取不同產(chǎn)地石榴皮粉末約1.0g，加體積分?jǐn)?shù)70%丙酮100mL，浸漬約14h，超聲處理30min，濾過，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)70%丙酮30mL洗滌，合并濾液和洗滌液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干丙酮溶液，加體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶液100 mL（內(nèi)含1.2mol·L－1的鹽酸），90℃回流8h，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘?jiān)眉状既芙?，定容?00 mL量瓶中。精密吸取10mL，置于50mL量瓶中，用甲醇定容，0.45μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日內(nèi)、日間標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果表明，日內(nèi)及日間標(biāo)準(zhǔn)差均小于2%，說明本法比較穩(wěn)定，重復(fù)性好。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定5份樣品，按2.2.4項(xiàng)方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鞣花酸含量，平均含量為89.30mg·g－1，RSD為1.43%，表明本方法重復(fù)性符合分析要求。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，24，36和48h迸樣測(cè)定，以峰面積計(jì)算，考察其48h內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為1.26%，表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品細(xì)粉適量，加入定量的沒食子酸對(duì)照品溶液，按2.1.4項(xiàng)方法制備溶液和測(cè)定，計(jì)算回收率，9次測(cè)得沒食子酸回收率為99.89%，RSD為1.43%，表明分析方法準(zhǔn)確，見表2。

表2 鞣花酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The results of recovery tests of ellagic acid （n＝9）

2.3 石榴皮中總多酚的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.5mg，置于100mL棕色量瓶中，蒸餾水溶解至刻度，搖勻。制成每1mL含沒食子酸0.055mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取上述沒食子酸對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和3.5mL，置于25 mL棕色量瓶中，分別加入磷鉬鎢酸試液1mL，再分別加水10.5，10，9.5，9，8和7.5mL，用290g·L－1碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度［12］，以吸光度A和質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A＝0.096 9 C＋0.060 8，r＝0.999 9（n＝6），沒食子酸在1.10～7.70μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 供試品溶液的制備 稱取20g石榴皮粉末，置于1 000mL圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇200mL，回流提取1h，過濾，真空濃縮，得石榴皮總多酚提取物，蒸餾水定容至100mL，精密吸取1mL稀釋至25mL，精密吸取2mL溶液，置于25mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1mL，加水9mL，用290g·L－1碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外－可見分光光度法在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日內(nèi)、日間標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果表明，日內(nèi)及日間標(biāo)準(zhǔn)差均小于2%，說明本法比較穩(wěn)定，重復(fù)性好。

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定5份樣品，按2.3.3項(xiàng)方法制成供試品溶液，測(cè)定總多酚含量，平均含量為179.80mg·g－1，RSD為1.23%，表明本方法重復(fù)性符合分析要求。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0，2，4， 6，12，24，36和48h迸樣測(cè)定，以峰面積計(jì)算，考察其48h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為1.43%，表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 HPLC圖A.沒食子酸對(duì)照品；B.供試品1；C.鞣花酸對(duì)照品；D.供試品2Fig.1 HPLC chromatogramsA.standard solution of gallic acid；B.test samples 1；C.standard solution of ellagic acid；D.test samples 2

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 新疆氣候干燥、光照時(shí)間充足，石榴產(chǎn)量較大，品種較多，我們采集了新疆石榴產(chǎn)量較大的13個(gè)品種，通過分別測(cè)定石榴皮中沒食子酸、鞣花酸、總多酚的含量，利用綜合評(píng)分篩選出最優(yōu)石榴皮品種，綜合評(píng)分如下：石榴皮的綜合評(píng)分＝鞣花酸／最大鞣花酸×30＋沒食子酸／最大沒食子酸×30＋總多酚／最大總多酚×40，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地的石榴皮中有效成分的含量測(cè)定及綜合評(píng)分Tab.3 The content and comprehensive score of effective components in pomegranate peel from different regions

由表3可以看出，新疆不同地區(qū)出產(chǎn)的石榴皮中沒食子酸的含量差異較大，喀什市葉城縣酸石榴皮中沒食子酸的含量最高，達(dá)到4.64mg·g－1，和田皮亞曼石榴皮中沒食子酸的含量最低，只有1.30 mg·g－1，同一地區(qū)酸石榴比甜石榴沒食子酸含量高。石榴皮中鞣花酸的含量較高，喀什市酸石榴皮中鞣花酸含量高達(dá)104.5mg·g－1，石榴皮中總多酚以阿圖什松他克鄉(xiāng)酸石榴含量最高，達(dá)到185.02 mg·g－1，石榴皮中總多酚、沒食子酸、鞣花酸均是同一地區(qū)酸石榴高于甜石榴，提示酸石榴口感較差可能與石榴中鞣質(zhì)含量較高有關(guān)。

通過對(duì)新疆不同石榴品種皮中沒食子酸、鞣花酸、總多酚進(jìn)行測(cè)定和綜合評(píng)分比較，酸石榴評(píng)分均高于甜石榴，喀什市酸石榴皮綜合評(píng)分最高，表明喀什市酸石榴皮中鞣質(zhì)含量較高，和田皮亞曼石榴皮綜合評(píng)分最低，皮中鞣質(zhì)含量最低。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了新疆不同產(chǎn)地的酸、甜石榴皮中有效成分，選取沒食子酸、鞣花酸、總多酚為指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，不同石榴品種皮中有效成分存在差異，這主要與每一地區(qū)的光照、氣候、雨水以及田間管理可能有關(guān)。

曾嘗試用甲醇或丙酮提取石榴皮中沒食子酸，用乙腈－1mL·L－1磷酸（10∶90）、甲醇－1mL·L－1磷酸（8∶92）、甲醇－四氫呋喃－冰乙酸－水（0.1∶0.5∶2∶97.4）、甲醇－0.5mL·L－1磷酸（5∶95）等溶劑系統(tǒng)作流動(dòng)相，結(jié)果分離度較差，干擾峰較多，采用水與乙醚進(jìn)行提取，甲醇－2mL·L－1磷酸（3∶97）作為流動(dòng)相進(jìn)行分離，結(jié)果干擾峰較少，分離度較好，方法重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

通過綜合評(píng)分篩選出喀什市酸石榴皮評(píng)分最高，和田市皮亞曼石榴皮評(píng)分最低，酸石榴皮評(píng)分普遍比甜石榴皮高，酸石榴酸澀，鞣質(zhì)含量較高于甜石榴。

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Screening of pomegranate peel from different regions in Xinjiang

CHANG Zhanying1，LIU Guihua2，CHEN Xueshan1，GAO Xiaoli1，Gulibahar KAWUL1＊（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Institute of Meteria Medica，Urumqi 830004，China）

Objective Through the comprehensive score method to screen the optimal pomegranate variety.Methods The gallic acid and ellagic acid contents were analyzed by HPLC；The total polyphenol content was analyzed by ultraviolet spectrophotometry.Results The linear range of gallic acid was 10.88－348μg·mL－1（r＝0.999 8），ellagic acid was 9.94－318μg·mL－1（r＝0.999 9），and gallic acid was 1.1－7.7μg·mL－1（r＝0.999 9）.Conclusion Through comprehensive evaluation pomegranate from Kashi city was selected.

pomegranate；gallic acid；ellagic acid；total polyphenol

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.009

R284

A

1004－2407（2015）04－0358－04

2014－02－18）

新疆醫(yī)科大學(xué)2013年科研創(chuàng)新基金（編號(hào)：XJC201305）

常占瑛，男，實(shí)驗(yàn)師

＊通信作者：古麗巴哈爾·卡吾力，女，副教授