反相－混合柱色譜串聯(lián)MS法探索中藥半夏的化學(xué)成分

徐文英，劉春生，馮孟鑫，馬愷悅，高山山，侯文珍，王佳宇，馬長華（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

反相－混合柱色譜串聯(lián)MS法探索中藥半夏的化學(xué)成分

徐文英，劉春生，馮孟鑫，馬愷悅，高山山，侯文珍，王佳宇，馬長華＊（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 對中藥半夏中在C18色譜柱上保留較弱的化學(xué)成分進(jìn)行分離與鑒定。方法 首先采用Waters X－Bridge C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）對半夏藥材酸水提取液進(jìn)行分離，然后對半夏提取液中在C18柱上保留較弱的成分采用Tech MateTX色譜柱（120A，150mm×2.0mm，5μm）（SCX與反相C18混合填料色譜柱）進(jìn)行進(jìn)一步分離分析，最后采用LC－MS對所分離成分進(jìn)行鑒定，ESI正離子模式掃描分析。結(jié)果 根據(jù)正離子模式下獲得的各色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，共檢測到13個(gè)主要的化學(xué)成分，其中3個(gè)通過與文獻(xiàn)對照或根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律得到了確認(rèn)，分別為：纈氨酸，腺嘌呤，精氨酸；化合物1，2，4，5，7，8和13推測為：5－羥甲基糠醛，6 H－purin－6－1，2－amino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），環(huán)－（纈氨酸－酪氨酸），環(huán)－（亮氨酸－酪氨酸），亮氨酸－異亮氨酸，（－）－pohakulin pohakuline，N－（1－（苯基乙?；璍－脯氨酰）甘氨酸乙酯，化合物9推測為某種環(huán)肽；化合物10和11由于缺乏相關(guān)對照品和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分析鑒定。結(jié)論 在C18柱上死時(shí)間內(nèi)流出而不能很好分離的物質(zhì)，在混合填料柱上得到了進(jìn)一步分離，這說明在某種程度上，采用單一固定相不能很好分離的某些化合物可以采用混合固定相色譜柱達(dá)到進(jìn)一步分離，尤其是在對復(fù)雜體系樣品的分離及鑒定過程中，混合固定相色譜柱將具有良好的應(yīng)用前景。

半夏；混合固定相；高分辨質(zhì)譜

半夏為天南星科半夏屬植物半夏（Pinellia ternate（Thunb.）Breit.）的干燥塊莖，已有2 000多年的用藥歷史［1－2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在558個(gè)中藥處方中，半夏的使用頻率居第22位。在傳統(tǒng)用藥中，半夏可用于燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)，外用可用于急性乳腺炎等。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，半夏還具有抗腫瘤、護(hù)肝、抗生育、治療冠心病、降血脂等多種重要作用［3］。目前，2010年版《中國藥典》采用電位滴定法測定其總酸含量［4］，對半夏藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，此法靈敏快速，能在一定程度上反映半夏的質(zhì)量。但半夏成分復(fù)雜，指標(biāo)性成分不明確，本課題組在半夏藥材一維色譜指紋圖譜建立的過程中，發(fā)現(xiàn)某些在C18為固定相的色譜柱上死體積內(nèi)流出的物質(zhì)往往會被忽略，而這些物質(zhì)中亦可能含有與藥效相關(guān)的成分。

研究表明，采用2種選擇性差別較大的固定相填料混合后裝柱，混合固定相色譜柱具有不同于2種單一固定相的選擇性［5］。為將半夏藥材中在單純C18色譜柱上保留較弱的成分進(jìn)行進(jìn)一步的分離分析，本實(shí)驗(yàn)采用C18色譜柱及Tech MateTX色譜柱（SCX與反相C18混合填料色譜柱）構(gòu)建離線二維色譜，將半夏藥材中在單純C18色譜柱上保留較弱的成分（前5min內(nèi)流出的成分）進(jìn)一步采用Tech MateTX色譜柱進(jìn)行分離分析，并采用LC－MS對所分離的成分進(jìn)行鑒定，以期獲得半夏藥材中盡可能多的化學(xué)成分信息，同時(shí)對混合固定相填料的色譜柱在中藥分離分析中的適用性進(jìn)行初步探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 1525高效液相色譜儀（Waters 2707自動進(jìn)樣器，柱溫箱，Waters 2998二極管陣列檢測器，Waters 1525泵，breeze TM2色譜工作站）；LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀與Accela高效液相色譜儀（Thermo公司）；分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；pH計(jì)（PB－10）；KQ－300GVDV型超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 半夏藥材，購自北京華邈醫(yī)藥公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖；乙腈（Fisher公司）為色譜純；流動相用水為娃哈哈純凈水；甲酸、甲酸銨（分析純，北京化工廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 第一維色譜分析條件

2.1.1 供試品溶液的制備 取60℃干燥至恒質(zhì)量的樣品粉末（60目）5g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)75%的酸性乙醇（體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸）溶液50mL，冷浸過夜，超聲提取30min，放冷，稱質(zhì)量，過濾，用體積分?jǐn)?shù)75%酸性乙醇（體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸）5mL，洗滌濾渣和濾器，合并濾液及洗液，備用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters X－Bridge C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（B）：水（A），梯度洗脫：0～10min99.5%～99%A，10～15 min99%～98.5%A，15～30min98.5%～94.5%A，30～35min94.5%～90%A，35～45min90%～85% A，45～50min85%～74%A，50～62min74%～67% A，62～87min50%～50%A，87～92min50%～99.5%A；流速：1mL·min－1；檢測波長：254nm。2.1.3 樣品測定 供試品溶液過0.45μm濾膜后，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣50μL，記錄其色譜圖，如圖1所示。

2.2 第二維混合色譜柱串聯(lián)MS分析條件

2.2.1 供試品溶液制備 SunFireTMPrep C18色譜柱（150mm×10mm，10μm）；按2.1.2項(xiàng)下梯度洗脫條件進(jìn)樣100μL，流速：2.17mL·min－1；收集前5min內(nèi)流出的組分，冷凍干燥，加入10mL體積分?jǐn)?shù)30%的乙腈甲酸水（pH＝3.0）溶液溶解，備用。

2.2.2 色譜條件 色譜柱（120A，150mm×2.0 mm，5μm）；流動相：乙腈－甲酸水溶液（pH＝3.0）30∶70（A），50mmol·L－1甲酸銨水溶液（甲酸調(diào)pH＝3.0）50∶50（B），梯度洗脫：0～30min100%～50% A，30～50min50%～50%A，50～60min50%～0% A，60～80min0%～0%A，80～83min0%～100% A；柱溫：20℃，流速：0.2mL·min－1，進(jìn)樣量：20μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 檢測模式為：ESI＋，毛細(xì)管溫度為275℃，噴霧電壓為4.5kV，霧化氣（N2）壓力40 Psi，干燥氣（N2）流速10.0L·min－1，掃描范圍為m／z＝50～1 500，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)為Xcalibur v2.0.7。2.2.4 樣品測定 供試品溶液過0.45μm濾膜后，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL，按照2.2.3項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，記錄其總離子流圖及各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)的色譜圖，部分樣品的提取離子流圖見圖2，所鑒定化合物的保留時(shí)間與一級和二級質(zhì)譜以及相關(guān)分子式信息見表1。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

半夏第一維色譜C18色譜柱色譜圖見圖1；部分化合物提取離子色譜圖見圖2。

圖1 半夏第一維色譜C18色譜柱色譜圖Fig.1 The first dimension chromatography on C18column of Pinellia ternata

圖2 部分化合物提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of the components

由圖1可以看出，當(dāng)流動相中水的比例高達(dá)99%時(shí)，半夏藥材在C18色譜柱上前5min內(nèi)流出的化合物仍未能得到較好分離，而此部分化合物中可能也含有與其藥效相關(guān)的化合物。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用Tech MateTX混合填料的色譜柱對此部分化合物進(jìn)行進(jìn)一步分離，以期探索得到半夏中更多的化合物信息。半夏第一維色譜前5min流出物質(zhì)的HPLC－MS－MS分析的部分提取離子色譜圖如圖2所示。對比兩圖可知，在C18柱上前5min內(nèi)被洗脫而未被很好分離的物質(zhì)，在混合固定相的色譜柱上有了進(jìn)一步分離。其中有6個(gè)色譜峰得到較好分離，結(jié)合HPLC的保留時(shí)間值以及參考文獻(xiàn)報(bào)道，并根據(jù)所得到的一級質(zhì)譜給出的準(zhǔn)分子離子峰信息和所得到的二級質(zhì)譜推測出的結(jié)構(gòu)碎片信息，共推測出13個(gè)化學(xué)成分的可能結(jié)構(gòu)，這些成分在前期文獻(xiàn)中都曾有報(bào)道［6－7］，通過對比文獻(xiàn)中相關(guān)化合物的一級和二級質(zhì)譜信息，化合物3，6和12得到了確證，分別為：纈氨酸，腺嘌呤，精氨酸；化合物1，2，4，5，7，8和13推測為5－羥甲基糠醛，6 H－purin－6－1，2－a－mino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），環(huán)－（纈氨酸－酪氨酸），環(huán)－（亮氨酸－酪氨酸），亮氨酸／異亮氨酸，（－）－pohakulin pohakuline，N－（1－（苯基乙?；璍－脯氨酰）甘氨酸乙酯，化合物9推測為某種環(huán)肽；化合物10和11由于缺乏相關(guān)對照品和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分析鑒定。表1給出了所有化合物的保留時(shí)間與一級和二級質(zhì)譜以及相關(guān)分子式信息。

表1 被鑒定化合物的保留時(shí)間、一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜和分子式Tab.1 The retention time and formula and MS1－MS2of the identification compounds

4 結(jié)論

由以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，采用C18色譜柱及混合填料色譜柱搭建離線二維液相色譜可以簡單快速地分離鑒別半夏酸水提取液中極性較大的化學(xué)成分。此外，在C18填料色譜柱上保留較弱的物質(zhì)（死時(shí)間內(nèi)流出的物質(zhì)）在混合填料色譜柱上有了進(jìn)一步的分離，這說明，相比于單一C18填料而言，混合填料的色譜柱可以大大提高色譜柱的選擇性，使樣品的分析更有針對性，分離性能也優(yōu)于單一固定相，進(jìn)而改善HPLC分離。而且，將此種混合填料的色譜柱與MS串聯(lián)使用時(shí)，還可以克服在實(shí)際分析檢測工作中，尤其是復(fù)雜樣品（如中藥）的分析中的流動相不兼容的缺點(diǎn)，因此，混合填料的色譜柱在分析工作中具有良好的應(yīng)用前景。本文僅初步探索了混合填料SCXC18＝1∶4的色譜柱，復(fù)雜的樣品體系也只選擇了中藥材半夏中在C18色譜柱上死時(shí)間內(nèi)較難很好分離的化合物體系，今后可以嘗試諸如C8－SCX和C8－HILIC等更多的混合固定相體系，研究對象也可以放大為更多的成分復(fù)雜的中藥材，進(jìn)而對該類型的體系進(jìn)行更深入地研究?？梢韵嘈?，基于混合填料色譜原理不斷優(yōu)化出的色譜柱及其色譜體系會更好地應(yīng)用于中藥成分的分離分析及化合物的分離鑒定等分析領(lǐng)域。

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［4］國家藥典委員會.《中國藥典》2010年版［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：89.

［5］傅若農(nóng).氣相色譜混合固定相和其中的“協(xié)同效應(yīng)”［J］.國外分析儀器，1997，7（1）：29－32.

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Study on the chemical composition of traditional Chinese medicine Pinellia ternate by C18－mixed－stationary phase column LC－MS

XU Wenying，LIU Chunsheng，F(xiàn)ENG Mengxin，MA Kaiyue，GAO Shanshan，HOU Wenzhen，WANG Jiayu，MA Changhua＊
（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To separate and identify the chemical compositions of Pinellia ternate which is slightly reserved on the C18column.Methods Firstly a Waters X－Bridge C18column was used to separate the acidic water extract of Pinellia ternate，and then the Tech MateTXcolumn（120A，150mm×2.0mm，5μm）（SCX－C18mixed stationary phase column）was used to separate the components that slightly retained on the C18column，and finally the components that slightly retained on the C18column were separated and identified by LC－MS－ESI in a positive ion mode.Results According to the positive ion mode available mass spectral data for each chromatographic peak，13major chemical constituents were detected，3of which were confirmed by literature or under the control of MS fragmentation mechanism.They were adenine，valine，and arginine.Compounds 1，2，4，5，7，8and 13were：5－h(huán)ydroxymethyl furfural，6 H－purin－6－1，2－amino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），ring－（Val Tyr），cyclo（leu－tyr），leucine－isoleucine，（－）－pohakulinpohakuline，and N－（1－（phenylacetyl）－L－prolyl）glycine ethyl ester.Compound 9was presumed to be a cyclic peptide；due to the lack of control and related literatures，the structure of compounds 10and 11need to be identified for further analysis.Conclusion The substances which were flowed out in the dead time on the C18column can be separated on the mixed－stationary phase column.The mixed－stationary phase will has a good application prospects.

Pinellia ternate；mixed－stationary phase；high－resolution mass spectrometry

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.008

R284

A

1004－2407（2015）04－0354－04

2015－04－10）

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：7142101）

徐文英，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：馬長華，男，教授，碩士生導(dǎo)師