不同工藝制備延胡索提取物的FTIR譜圖特征分析

王 媚，史亞軍，年娟娟，王雍卿，劉 力（陜西中醫(yī)學院藥學院中藥制藥重點學科，咸陽 712046）

不同工藝制備延胡索提取物的FTIR譜圖特征分析

王 媚，史亞軍＊，年娟娟，王雍卿，劉 力（陜西中醫(yī)學院藥學院中藥制藥重點學科，咸陽 712046）

目的 考察延胡索不同提取物粉末的紅外光譜學特征，建立延胡索提取物的質量檢測方法，為中藥提取物的實時質量監(jiān)控提供參考。方法 以延胡索乙素為指標，采用HPLC測定其含量；利用傅里葉變換紅外光譜技術（FTIR）對延胡索藥材及其不同提取物進行研究。結果 延胡索藥材及其提取物有著各自穩(wěn)定的紅外光譜指紋特征，圖譜中位于1 610，1 520和1 457cm－1處的振動峰是判斷延胡索乙素在不同提取物樣品中含量高低的主要依據(jù)，而其測定結果與HPLC的結果基本吻合。結論 該方法簡便、快速，能夠準確地提供中藥提取物中主要化學成分的相關信息，為制定下一步的提取方案提供方向性參考。

延胡索；延胡索乙素；中藥提取物；傅里葉變換紅外光譜法

延胡索為罌栗科植物Rhizoma corydalis W.T.Wang的干燥塊莖，具有活血、止痛之功效，臨床主要用于治療各種疼痛等［1］。延胡索中的延胡索乙素等叔胺類生物堿是其作用的主要物質基礎，常用液相色譜、毛細管電泳等方法來測定藥材提取物中延胡索乙素的含量［2－6］。這種以測定某一種有效成分或指標成分為目標的分析方法，從中醫(yī)藥的多組分整合調節(jié)作用的觀點看，這些指標成分的控制難以真正控制中藥功效。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）法具有取樣量小、簡便迅速、準確等優(yōu)點，且無需樣品分離提取，不破壞樣品的原本性，即可獲得藥材的宏觀整體信息。因此，它可用于作為評價中藥質量的一項關鍵指標。已有報道將紅外光譜技術應用于中藥材質量控制方面的研究［7－15］。

本文以延胡索為研究對象，通過對其藥材和不同提取物粉末樣品紅外光譜的分析比較，建立無損、快速地測定延胡索不同工藝提取物的紅外分析方法，為制定下一步提取方案和檢測方法提供方向性參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 TENSOR－27型傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克公司）；BT25S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；769YP－15A型粉末壓片機（上海新諾儀器設備有限公司）；瑪瑙研缽。

1.2 試藥 延胡索購自西安盛興中藥飲品有限責任公司；延胡索對照藥材和延胡索乙素對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；溴化鉀為光譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：2013923）；甲醇為色譜純；其他試劑為分析純；水為二次去離子水。實驗中藥材樣品經陜西中醫(yī)學院藥學院王西芳教授鑒定。

2 方法

2.1 樣品提取

2.1.1 藥典法提取 分別取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）約2g，精密稱定，置于平底燒瓶中，精密加入濃氨試液－甲醇（1∶20）混合溶液200mL，稱定質量，冷浸1h后加熱回流1h，放冷，再稱定質量，用濃氨試液－甲醇（1∶20）混合溶液補足減失的量，搖勻，濾過，備用。平行制樣3份。

2.1.2 索氏法提取 分別取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）約2g，精密稱定，置于索氏提取器中，精密加入體積分數(shù)80%乙醇溶液200mL，水浴回流提取5h，濾過，備用。平行制樣3份。

2.1.3 超聲法提取 分別取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）約2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數(shù)80%乙醇溶液200mL，稱定質量，超聲處理1h，放冷，再稱定質量，用體積分數(shù)80%乙醇溶液補足減失的量，搖勻，濾過，備用。平行制樣3份。

2.1.4 回流法提取 分別取延胡索粗粉（65目）和超微粉（300目）約2g，精密稱定，置于平底燒瓶中，精密加入體積分數(shù)80%乙醇溶液200mL，水浴回流提取2次，第1次2h，第2次1h，濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至200mL，搖勻，備用。平行制樣3份。

2.2 紅外樣品制備 分別取上述提取液適量在水浴上蒸干，得粉末樣品。再分別精密稱取上述4種提取物粉末、藥材及化學對照品粉末與KBr按照300∶1（使其最強吸收峰的透射率在10%以下）的比例混合，在紅外燈下混合后充分研磨均勻，放入模具內，作用2min，壓強為9.81×108Pa，取出，得直徑13mm、厚度為0.5mm左右的供試片，立即放入樣品架進行測定。

2.3 樣品測定及圖譜處理 采用TENSOR－27型傅里葉變換紅外光譜儀，設定掃描累加次數(shù)16次，分辨率為4cm－1，將壓好的供試片在4 000～400cm－1光譜范圍內進行掃描測定，并實時扣除H2O和CO2干擾；將得到的各個樣品的紅外光譜圖，對其分別進行基線校正、平滑等處理，保存處理后的譜圖即可。

3 結果

3.1 HPLC測定延胡索乙素含量

3.1.1 色譜條件 Agilent C18（250mm×4.6mm，5 μm）；以甲醇1mL·L－1磷酸溶液（三乙胺調pH值至6.0）（55∶45）為流動相；流速1.0mL·min－1，檢測波長為280nm，柱溫為30oC。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計算應不低于3 000［1］。

3.1.2 對照品溶液的制備 取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含102μg的溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

3.1.3 供試品溶液的制備 分別精密量取2.1項下各續(xù)濾液50mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

3.1.4 標準曲線的制備 取延胡索乙素對照品適量，精密稱定，置于10mL的量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，得質量濃度為146μg·mL－1的標準儲備液，再逐級稀釋成質量濃度為20，40，60，80，100和120μg·mL－1的系列標準液。分別吸取上述溶液各20μL按上述色譜條件注入色譜儀，測定其峰面積，以峰面積為縱坐標（Y）、對照品質量濃度（μg·mL－1）為橫坐標（X）繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝24.708 X－55.333，相關系數(shù)r＝1.000 0。延胡索乙素的進樣質量濃度在20～120μg·mL－1范圍內，其峰面積與質量濃度呈良好的線性關系。

3.1.5 精密度實驗 精密吸取300目藥典法提取的供試品溶液，在3.1.1色譜條件下，連續(xù)進樣5次，記錄峰面積。結果提取液的RSD為0.297%，結果表明儀器精密度良好。

3.1.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一300目藥典法提取的供試品溶液，分別于0，4和8h，按照3.1.1色譜條件測定其不同時間的峰面積，RSD為0.77%，說明供試品溶液在8h內穩(wěn)定性良好。

3.1.7 重復性實驗 取同一300目樣品6份，按照2.1.1項下的方法制樣，在3.1.1色譜條件下進行分析，共測定6次，結果延胡索乙素含量的平均值為0.192 1%，RSD為1.21%，n＝6。表明重復性較好。

3.1.8 加樣回收率實驗 精密稱取供試品溶液6份，分別精密加入延胡索乙素對照品溶液5.2，6.5，和7.8mL，測定樣品中的含量，計算回收率。結果延胡索乙素的平均回收率為98.031%，RSD為1.28%，結果表明本法回收率良好。

3.1.9 含量測定 取供試品溶液各20μL按上述色譜條件分別注入色譜儀，測定峰面積（Y），將結果代入3.1.4中的回歸方程，計算延胡索乙素含量（%），結果見圖1和表1。

圖1 高效液相色譜圖a.回流法樣品；b.超聲法樣品；c.藥典法樣品；d.索氏法樣品；e.延胡索乙素對照品Fig.1 HPLC chromatogramsa.sample by reflux method；b.sample by ultrasound method；c.sample by China Pharmacopoeia method；d.sample by Soxhlet method；e.tetrahydroplmatine reference substance

3.2 延胡索藥材和延胡索乙素對照品的紅外光譜圖分析 延胡索的有效成分是生物堿，延胡索乙素為其中最主要的成分。圖2為延胡索乙素對照品和延胡索對照藥材的紅外光譜圖。由圖2可看出，雖然在1 200～800cm－1延胡索圖譜的峰重疊較為嚴重，但是在1 651，1 517，1 456，1 420，1 372和1 240cm－1波段的特征峰表現(xiàn)出了延胡索乙素的1 610，1 520，1 457，1 427，1 391和1 230cm－1指紋特征峰；另外，延胡索的階梯峰1 156，1 080和1 022cm－1與延胡索乙素的1 142，1 082和1 029cm－1一一對應。因此，結合紅外光譜結構，以1 651，1 517，1 456，1 420，1 372，1 240，1 156，1 080和1 022cm－1可以作為延胡索藥材的特征相關峰。其中延胡索乙素在1 610，1 520和1 457cm－1處的峰高作為判斷其含量高低的主要依據(jù)。

圖2 延胡索對照藥材和延胡索乙素對照品的紅外光譜圖1.延胡索對照藥材；2.延胡索乙素對照品Fig.2 FTIR spectra of Rhizoma corydalis and tetrahydroplmatine1.Rhizoma corydalis；2.tetrahydroplmatine

3.3 延胡索藥材與粗粉延胡索不同提取物的紅外光譜圖比較 圖3顯示了延胡索對照藥材和不同提取物的紅外光譜圖。結果顯示，4種提取物的紅外光譜圖在1 632，1 520和1 384cm－1處與藥材在1 651，1 517和1 372cm－1處的峰是一一對應的，并且4種提取物的峰位更接近于延胡索乙素對照品的相關特征峰位。與延胡索藥材相比，4種提取物中延胡索乙素的含量明顯增加，這是由延胡索乙素在1 610，1 520和1 384cm－1處的峰在整體譜圖中表現(xiàn)的峰形和峰強決定的。此處的峰在整體譜圖中表現(xiàn)的峰越強，峰形越尖，則該提取物中的延胡索乙素的富集程度越高。此外，提取物中的階梯峰1 156，1 080和1 029 cm－1也能幫助判斷延胡索乙素在整個提取物譜圖中的含量。

由圖3還可以看出，索氏提取法的提取物譜圖明顯高于藥典、超聲、回流法的，也高于藥材本身的譜圖。這充分說明了提取工藝對延胡索藥材中的延胡索乙素進行了不同程度的富集，同時也說明了不同的提取方法之間是有差異的。

圖3 延胡索對照藥材與粗粉延胡索不同提取物的紅外光譜圖1.索氏法提?。?.藥典法提?。?.超聲法提??；4.回流法提??；5.延胡索對照藥材Fig.3 FTIR spectra of Rhizoma corydalis and its different extracts1.extracts of Soxhlet；2.extracts of China Pharmacopeia；3.extracts of ultrasound；4.extracts of reflux；5.Rhizoma corydalis

3.4 延胡索藥材與300目延胡索不同提取物的紅外光譜圖比較分析 圖4顯示了延胡索對照藥材和300目不同提取物的紅外光譜圖。圖4與圖3相似，可以看出，提取物中延胡索乙素的富集程度是：索氏法＞藥典法＞回流法＞超聲法，也遠遠高于藥材本身的含量。這進一步說明了提取工藝對延胡索藥材中的延胡索乙素進行了不同程度的富集。同時，結合表1的數(shù)據(jù)也可以看出，300目提取物中延胡索乙素的富集效果基本上要高于粗粉中的富集效果，雖然變化規(guī)律和平行的以延胡索乙素為指標成分的HPLC實驗結果不太吻合，如回流的含量相差較大。說明微觀的以單一成分為標準的HPLC測定結果與宏觀的紅外光譜所反映的整體實驗結果是可能吻合的。

從表1可以看出，延胡索超微粉的提取率均大于粗粉。由于索氏提取法提取率高、穩(wěn)定性好，又考慮實驗易實現(xiàn)，建議在對延胡索中延胡索乙素的含量進行測定時，選擇粗粉索氏提取法為宜。

圖4 延胡索對照藥材與300目延胡索不同提取物的紅外光譜圖1.索氏法提??；2.藥典法提??；3.超聲法提取；4.回流法提取；5.延胡索對照藥材Fig.4 FTIR spectra of Rhizoma corydalis and the different extracts of 300mesh Rhizoma corydalis1.extracts by Soxhlet method；2.extracts by China Pharmacopeia method；3.extracts by ultrasound method；4.extracts of refluxh；5.Rhizoma corydalis

3.5 相關性分析

用不同粉碎度（目）、不同提取物譜圖中延胡索乙素的相關特征峰位的峰強與HPLC的測定結果來建立方程。見表1。以1 632和1 384cm－1的峰強數(shù)據(jù)分別為自變量X1和X2，以HPLC的測定結果為因變量Y，使用統(tǒng)計軟件SPSS Statistics Base 17.0，采用向后回歸法建立方程。方程如下：Y1＝－1.121 X1＋1.303 X2＋0.118，R21＝0.994，P＜0.05；Y2＝1.115 X1－1.237 X2＋0.060，R22＝0.860，P＜0.05。從結果可看出，不同粉碎度（目）、不同提取物的紅外光譜數(shù)據(jù)與對應的HPLC數(shù)據(jù)之間呈線性關系，因此具有相關性。

4 討論

延胡索對照藥材和提取物中的每一特征峰能與延胡索乙素對照品的特征峰構成一一對應關系，盡管有一些峰有稍微的位移，但波動較小，相關的峰數(shù)較多，表明在延胡索提取物樣品中主要成分延胡索乙素富集程度很高，延胡索中延胡索乙素的含量為0.06%［16］，這為紅外光譜整體鑒別延胡索取得良好效果奠定了基礎。實驗中，延胡索4種提取物樣品的紅外光譜圖既有相關性，又有區(qū)別。相應的共有特征峰均已在圖譜上體現(xiàn)，指紋特征的相關性很好；各提取物的整體譜圖明顯高于藥材的紅外譜圖，說明該提取物樣品中以延胡索為代表的主要成分得到了有效富集；而4種提取物中延胡索乙素的含量又有一定的差別，說明索氏提取對延胡索乙素的富集效果優(yōu)于藥典法、回流法和超聲法。因此，通過分析比較藥材和不同提取物的紅外光譜，可以宏觀整體地把握中藥各級提取物中的化學信息，從而為下一步化學成分的微觀分析提供方向性參考；另外根據(jù)紅外光譜圖提供的化學成分差異信息，可以及時指導中藥提取分離工藝的改進和優(yōu)化。

表1 峰強比和HPLC法測定不同方法提取的延胡索乙素Tab.1 Ratio of peak intensity and HPLC results of tetrahydropalmatine in different methods for extraction

中藥的紅外光譜是復雜體系的整體紅外光譜，具有宏觀的指紋特性。中藥提取物是對中藥的進一步加工，能夠對有效成分進行富集；從形態(tài)學角度研究中藥提取物紅外光譜的指紋或特征譜為優(yōu)化提取工藝提供參考，而不是像確定官能團那樣去解析光譜的理論已經開始得到認可［17］，因此，紅外光譜可以作為用于評價延胡索提取物質量的一項關鍵指標。

5 結論

本實驗表明，利用傅里葉變換紅外光譜技術能夠快速、簡便地提供延胡索提取物中主要化學成分的定性和半定量信息，并且結合高效液相色譜法對含量進行測定，結果滿意。因此，該實驗可為制定下一步的提取方案、后續(xù)化學成分的分析以及中藥提取分離工藝的改進提供有效參考；同時可作為中藥提取物質量控制的重要手段之一。

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FTIR analysis of Rhizoma corydalis extracts prepared by different procedures

WANG Mei，SHI Yajun＊，NIAN Juanjuan，WANG Yongqing，LIU Li（Chinese Pharmaceutical Key Discipline and Specialties，College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China）

Objective In order to control the quality of Rhizoma corydalis a novel method was established to measure the traditional Chinese medicine extracts of Rhizoma corydalis，in which the characteristic peaks was investigated by Fourier transform infrared spectroscopy（FTIR）.Methods The content of tetrahydropalmatine was determined by HPLC；The characteristic peaks were recognized and the FTIR spectra of Rhizoma corydalis and its different extracts were compared.Results The FTIR spectra of traditional Chinese medicine extracts of Rhizoma corydalis exhibited macroscopic fingerprint characteristics.The typical and strongest absorption peak in IR spectrum of tetrahydroplmatine was at 1 610，1 520and 1 457cm－1，which was assigned to the vibration band，and its intensities in spectra of different medicinal herb extracts became the main identification standard of the contents of tetrahydroplmatine in those samples.The results of tetrahydroplmatine from different extracting methods were consistent with the results of HPLC.Conclusion The method is simple and rapid，which could provide valuable information about the chemical constituents of medicinal extracts for guiding the next step of extraction and separation improvement.

Rhizoma corydalis；tetrahydroplmatine；medicinal extracts；Fourier transform infrared spectroscopy

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.004

R284

A

1004－2407（2015）04－0340－05

2014－12－04）

陜西省教育廳科研計劃資助項目（編號：12JS038）；陜西省重點科技創(chuàng)新團隊項目（編號：2013KCT－26）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（編號：2011KTCG03－02）

王媚，女，碩士，實驗師

＊通信作者：史亞軍，男，博士，副教授