響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取燈心草中去氫厄弗酚的工藝

付 茜，王勤輝，孫 璐，江美芳，黃建梅（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

·中藥及天然藥物·

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取燈心草中去氫厄弗酚的工藝

付 茜，王勤輝，孫 璐，江美芳，黃建梅＊（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 以甲醇為提取溶劑，用超聲法從燈心草中提取去氫厄弗酚。方法 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，分別考察超聲提取時(shí)間、超聲提取功率、甲醇體積分?jǐn)?shù)對去氫厄弗酚提取率的影響，確定各因素的適宜水平。在此基礎(chǔ)上，利用Box－behnken中心組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲功率3個(gè)因素對去氫厄弗酚提取率的影響，建立二次回歸方程，分析最佳提取工藝。結(jié)果 燈心草中去氫厄弗酚超聲提取的最佳工藝為：甲醇體積分?jǐn)?shù)為80.4%，超聲時(shí)間為40min，超聲功率為40%P（P＝400W），在此條件下，去氫厄弗酚提取量達(dá)到1.003 0mg·g－1。結(jié)論 Box－behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法操作簡單，可以更好地對燈心草中去氫厄弗酚的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

燈心草；去氫厄弗酚；響應(yīng)面分析；超聲提取

燈心草（Juncus effusus L.）為燈心草科燈心草屬多年生草本植物，入藥部位為干燥莖髓，臨床主要用于治療因心火所致的心煩失眠、尿少澀痛、口舌生瘡［12］。我國燈心草資源十分豐富，國內(nèi)外對其成分研究也較為透徹，菲類、黃酮類、三萜類和甘油酯類為其主要化學(xué)成分［3－9］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：不同產(chǎn)地?zé)粜牟葜谢瘜W(xué)成分相似度很高，且菲類成分為其最主要成分［10］；同時(shí)利用成分敲除技術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：菲類成分是燈心草中的抗焦慮活性物質(zhì)［11］，其中去氫厄弗酚含量最高，為清心除煩的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［12－13］。而目前對燈心草中菲類化合物的提取工藝尚未報(bào)道，有必要對其提取工藝進(jìn)行研究。本文先進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察，后采用響應(yīng)面中心組合方法設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化燈心草中去氫厄弗酚的超聲提取條件，為燈心草中菲類成分的高效提取提供理論依據(jù)，也為燈心草的臨床前研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC－20A型高效液相色譜儀（SPD－20A檢測器，日本島津公司）；安捷倫HC－C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；KQ3200DE型數(shù)控超聲提取器（昆山市超聲儀器公司）；BL－100多功能高速小型粉碎機(jī)（浙江永康五金公司）；CPA225D型Sartorius精密電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥 去氫厄弗酚對照品（實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）；液相用甲醇為色譜純（Fisher公司），水為娃哈哈純凈水；超聲提取用甲醇為分析純（北京化工廠）；燈心草髓部采購于江西撫州。

2 方法

2.1 去氫厄弗酚的測定方法

2.1.1 色譜條件 采用課題組前期段瓊等［14］的色譜條件：Agilent HC－C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇－水（65∶35）；流速為1.0mL·min－1；柱溫23℃；檢測波長為270nm；進(jìn)樣量為10μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取去氫厄弗酚對照品25.00mg，加適量甲醇使其溶解，轉(zhuǎn)移至250mL量瓶中，用甲醇定容得100mg·L－1的對照品溶液。

2.1.3 樣品溶液的制備 取干燥燈心草髓部，粉碎后過60目篩。精確稱取0.20g粉末，精密加入20 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液，超聲提?。ǔ暪β蕿?0%P）30min，靜置放冷至室溫，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，即得樣品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取配制好的去氫厄弗酚對照品溶液0.1，0.25，0.5，1.5，2.5和10.0 mL，置于10mL量瓶中，定容稀釋至刻度，得1.0，2.5 ，5.0，15.0，25.0和100.0μg·mL－1的6份待測溶液。按照上述色譜條件，分別進(jìn)樣測定，以去氫厄弗酚對照品量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝84 773X＋18 483（r＝0.999 9），表明去氫厄弗酚的質(zhì)量濃度在1.00～100.00μg·mL－1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化去氫厄弗酚的提取條件 采用2.1項(xiàng)下的方法，固定其他影響因素不變，以去氫厄弗酚的提取率為指標(biāo)，對甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、超聲提取功率3個(gè)因素在一定范圍內(nèi)分別進(jìn)行考察。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化燈心草中去氫厄弗酚的提取工藝 本實(shí)驗(yàn)利用Design－expert V8.0.6.1軟件，以中心組合設(shè)計(jì)原理來設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。先以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，在一定范圍內(nèi)選取甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲功率3個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行考察，再以去氫厄弗酚提取率為響應(yīng)值，由程序設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)水平和因素見表1。

表1 響應(yīng)面－中心組合因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box－behnken

3 結(jié)果

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對去氫厄弗酚提取率的影響每次準(zhǔn)確稱取燈心草0.20g，分別選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%和90%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)燈心草中去氫厄弗酚的提取量隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加而相應(yīng)增加，但當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，去氫厄弗酚的量達(dá)到最大，且趨于穩(wěn)定。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，去氫厄弗酚的量略微下降，可能是與去氫厄弗酚的極性大小有關(guān)。故選定甲醇的體積分?jǐn)?shù)為70%左右。

3.1.2 超聲提取時(shí)間對去氫厄弗酚提取率的影響

每次準(zhǔn)確稱取燈心草0.20g，分別選擇超聲時(shí)間10，20，30，40和50min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果隨著超聲提取時(shí)間的增加，去氫厄弗酚的提取量會(huì)增加，當(dāng)達(dá)到30min時(shí)，其含量最高，之后，隨著超聲時(shí)間的增加，去氫厄弗酚提取量會(huì)稍有減少。可能是由于超聲時(shí)間過長，造成了目標(biāo)成分的破壞。故選定超聲提取時(shí)間在30min左右。

3.1.3 超聲提取功率對去氫厄弗酚提取率的影響每次準(zhǔn)確稱取燈心草0.20g，分別選擇超聲提取功率40%P，50%P，60%P，70%P和80%P（P＝400W）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果去氫厄弗酚的量隨著超聲功率的增大而稍有增加，到60%P時(shí)，提取量達(dá)到最大。之后，隨著超聲功率的增加，去氫厄弗酚的提取量會(huì)減少，可能是由于超聲功率過大，造成了目標(biāo)成分去氫厄弗酚的破壞。故選擇超聲功率在60%P左右比較適合。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化去氫厄弗酚的超聲提取條件 響應(yīng)面－中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)具體方案和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面－中心組合設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab.2 Experimental designs and results of Box－behnken

運(yùn)用響應(yīng)面法分析上述所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可計(jì)算得到以去氫厄弗酚提取量為響應(yīng)值的回歸方程：

Y＝0.91＋0.20A＋0.018B－3.84×10－3C－0.018 AB＋7.86×10－3AC－7.79×10－3BC－0.12 A2＋1.50×10－4B2＋0.021C2

式中：Y表示去氫厄弗酚提取量（mg·g－1），A表示甲醇體積分?jǐn)?shù)，B表示超聲時(shí)間，C表示超聲功率。

回歸統(tǒng)計(jì)得到分析結(jié)果，見表3。由表3可知，以去氫厄弗酚的提取量為響應(yīng)指標(biāo)時(shí)，模型P＜0.000 1，模型相關(guān)系數(shù)r＝0.997 4，表明該二次方程模型高度顯著，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。失擬項(xiàng)值為0.146 4，即方程模型失擬不顯著，說明一些未知因素對提取實(shí)驗(yàn)的影響很小。同時(shí)，可以得知各個(gè)因素對去氫厄弗酚提取率由大到小的影響依次為：甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲功率，其中對提取率影響最顯著的是甲醇體積分?jǐn)?shù)。方差分析的結(jié)果表明，方程的總模型、甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）及二次項(xiàng)對去氫厄弗酚提取率的影響極其顯著；超聲時(shí)間（B）及甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的相互作用（AB）對去氫厄弗酚提取率影響達(dá)到顯著水平，而交互項(xiàng)AC和BC對去氫厄弗酚提取率的影響不顯著。各因素間交互作用的響應(yīng)面圖見圖1。

表3 響應(yīng)面法對去氫厄弗酚提取量的方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis results of mean square deviation for extracting dehydroeffusol

圖1 兩因素交互作用對去氫厄弗酚提取量影響的響應(yīng)面圖A.甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間；B.甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率；C.超聲時(shí)間與超聲功率Fig.1 Response surface for the effect of extraction rateA.methanol concentration and ultrasonic time；B.methanol concentration and ultrasonic power；C.ultrasonic time and ultrasonic power

綜合以上響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，Design－expert程序可以預(yù)測出對燈心草髓部去氫厄弗酚提取的最優(yōu)化工藝為：甲醇提取的體積分?jǐn)?shù)為80.4%，超聲40 min，超聲功率為40%P（P＝400W），在此最佳條件下，去氫厄弗酚的提取量可達(dá)到1.006 2mg·g－1。3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化后的預(yù)測條件，即在甲醇的體積分?jǐn)?shù)為80.4%，超聲40min，超聲功率為40%P（P＝400W）條件下，得到平行實(shí)驗(yàn)3次的結(jié)果，其平均值為1.003 0mg·g－1，而軟件模型對去氫厄弗酚提取量的預(yù)測最佳值為1.006 2 mg·g－1，兩者誤差僅為0.32%，兩者十分吻合，說明建立的模型可行。同時(shí)，去氫厄弗酚的提取率與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，得率較高。

4 討論

去氫厄弗酚是燈心草清心除煩的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，有必要對其進(jìn)行快速、有效地提取，本實(shí)驗(yàn)研究了超聲提取燈心草中去氫厄弗酚的工藝，響應(yīng)面法優(yōu)化條件結(jié)果表明，甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間對去氫厄弗酚提取率有顯著影響，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，甲醇體積分?jǐn)?shù)起了決定性的作用，可以考慮固定甲醇的體積分?jǐn)?shù)，使其他影響因素可以在一定范圍內(nèi)變化，從而有效地提取去氫厄弗酚，為燈心草的工業(yè)化大生產(chǎn)提供依據(jù)。

超聲提取具有提取率高、適用性廣、耗能少等特點(diǎn)［15］。本文的研究結(jié)果也證實(shí)，Box－behnken響應(yīng)面法能快速有效地獲得更加優(yōu)化的提取條件，提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，方便簡單。該法尤其適合于探索性的實(shí)驗(yàn)研究，能更為準(zhǔn)確地指明實(shí)驗(yàn)方向［16］，可為中藥活性成分的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)，有較好的應(yīng)用前景。

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Optimization of ultrasonic－assisted extraction method of dehydroeffusol fromJuncus effusus by response surface methodology

FU Qian，WANG Qinhui，SUN Lu，JIANG Meifang，HUANG Jianmei＊（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To investigate the ultrasonic－assisted extraction method of dehydroeffusol fromJuncus effusus.Methods The effects of methanol concentration，extraction time，and extraction power were investigated.A 17－run response surface design involving three factors at three levels was generated by the design－expert software and the experimental data obtained were subjected to quadratic regression analysis，and to create a mathematical model describing the dehydroeffusol extraction.Results The optimal ultrasonic－assisted extraction conditions were as follows：methanol volume fraction 80.4%and ultrasound power 40%P（P＝400W）for 40min.Under these optimized conditions，the yield of dehydroeffusol was 1.003 0mg·g－1.Conclusion The Box－behnken design and response surface analysis can optimize the ultrasonic－assisted extraction conditions of dehydroeffusol fromJuncus effusus easily.

Juncus effusus；dehydroeffusol；response surface methodology；ultrasonic assisted extraction

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.001

R284

A

1004－2407（2015）04－0331－04

2015－03－10）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81173541）

付茜，女，碩士研究生

＊通信作者：黃建梅，女，教授，博士生導(dǎo)師