安神定志靈對(duì)SHR大鼠前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素alpha 2A受體蛋白表達(dá)的影響

雷 爽， 韓新民，*， 袁海霞， 孫繼超

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

安神定志靈對(duì)SHR大鼠前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素alpha 2A受體蛋白表達(dá)的影響

雷 爽1， 韓新民1，2*， 袁海霞2， 孫繼超2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023）

目的研究安神定志靈對(duì)注意缺陷多動(dòng)障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）動(dòng)物模型-自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous1y hypertensive rat，SHR）前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素a1pha2A受體（a1pha2A adrenergic receptor，ADRα2A）蛋白表達(dá)的影響，探討該藥治療ADHD的作用機(jī)制。方法40只自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為5組（模型組，托莫西汀組，安神定志靈低、中、高劑量組），每組8只，Wistar京都大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）8只作為正常對(duì)照組。安神定志靈低、中、高劑量組分別按生藥劑量11.85、23.7、47.4 g/（kg·d）灌胃，每日1次；托莫西汀組以5 mg/（kg·d）給予托莫西汀灌胃，每日1次；模型組和正常對(duì)照組每日按體質(zhì)量給予等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)4周后處死大鼠，采用免疫組化和Western b1ot法檢測(cè)各組大鼠前額葉皮質(zhì)腦組織ADRα2A蛋白表達(dá)水平。結(jié)果模型組和正常對(duì)照組比較，ADRα2A蛋白表達(dá)水平顯著降低 （P＜0.05）；托莫西汀組、安神定志靈各劑量組ADRα2A的表達(dá)水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），且以安神定志靈中劑量組的ADRα2A蛋白表達(dá)最為顯著，與托莫西汀組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)論托莫西汀及安神定志靈可以顯著上調(diào)SHR大鼠前額葉皮質(zhì)中ADRα2A蛋白的表達(dá)水平，說明前額葉皮質(zhì)去甲腎上腺素a1pha2A受體可能是安神定志靈的作用靶點(diǎn)之一。

安神定志靈；注意缺陷多動(dòng)障礙；自發(fā)性高血壓大鼠；去甲腎上腺素a1pha2A受體

注意力缺陷多動(dòng)障礙 （ADHD）是兒童期常見的精神行為障礙性疾病，全球?qū)W齡期兒童及青少年患病率約為5.29%［1］，對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的負(fù)面影響。ADHD的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳、環(huán)境、解剖及神經(jīng)遞質(zhì)等是目前研究的熱點(diǎn)。在臨床辨證中，韓新民教授提出該病實(shí)證病機(jī)多屬 “心肝火旺、痰火內(nèi)擾”，主以 “清心平肝，豁痰開竅，安神定志”為治則。安神定志靈是韓新民教授結(jié)合多年的臨床實(shí)踐，以上述治則為指導(dǎo)而形成的驗(yàn)方，前期臨床研究顯示療效確切［2］。對(duì)其實(shí)驗(yàn)作用機(jī)制也進(jìn)行了積極探索，主要集中在多巴胺系統(tǒng)水平上［3-4］。本實(shí)驗(yàn)從去甲腎上腺素角度，選用被認(rèn)為最具有特征性及目前最合適的自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)物模型［5］研究安神定志靈對(duì)去甲腎上腺素a1pha2A受體蛋白表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SHR大鼠40只，WKY大鼠8只，均為4周齡，雄性，體質(zhì)量65～90 g，清潔級(jí) （北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證 SCXK［京］2012-0001）。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲食進(jìn)水，正式試驗(yàn)之前適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

1.2 藥物 安神定志靈由醋柴胡、黃芩、石菖蒲、益智仁、郁金、炙遠(yuǎn)志等藥物組成 （江蘇省中醫(yī)院中藥房），按低、中、高劑量制成水煎劑，生藥質(zhì)量濃度分別為0.592 5、1.185、2.37 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；西藥托莫西?（產(chǎn)品批號(hào)C165365，英國禮來），用生理鹽水配制成終質(zhì)量濃度0.5 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；生理鹽水 （批號(hào)2012042409，南京小營藥業(yè)）。

1.3 主要儀器 電泳槽、Trans-B1ot SD蛋白半干轉(zhuǎn)印儀（美國Bio Rad公司）；面包式離心機(jī)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、移液槍 （德國Eppendorf公司）；漩渦振蕩器、轉(zhuǎn)移及水平搖床 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；精密天平、pH/酸度儀 （德國Sartorius公司）；制冰機(jī) （美國Scotsman公司）；酶標(biāo)儀（美國Peking E1mer公司）；Image Quant LAS 4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀（美國GE公司）；石蠟包埋機(jī)、全自動(dòng)組織脫水機(jī)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.4 主要試劑 4%多聚甲醛PBS緩沖液，10%水合氯醛；Envision免疫組化檢測(cè)試劑盒 （福建邁新生物技術(shù)有限公司）；﹟4970Sβ-actin多克隆抗體 （美國CST）；ab65833 ADRα2A抗體、羊抗兔二抗（美國Abcam）；RIPA裂解液（強(qiáng)）、PMSF、10%十二烷基磺酸鈉 （碧云天生物技術(shù)有限公司）；Trish-base、甘氨酸（北京索萊寶）；光明牌脫脂奶粉 （光明乳業(yè)）；2×上樣緩沖液、29∶1丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺混合物、過硫酸銨、PVDF膜（美國Bio Rad）；11-180kDa預(yù)染蛋白Marker（中國臺(tái)灣Genedirex）；ECL化學(xué)發(fā)光底物（美國Thermo）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及處理 40只自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，托莫西汀組，安神定志靈低劑量組、中劑量組、高劑量組。8只WKY大鼠被設(shè)為正常對(duì)照組。托莫西汀組給予臨床等效劑量5 mg/（kg·d），安神定志靈中劑量為臨床等效劑量23.7 g/（kg·d），低劑量組給藥11.85 g/（kg·d），高劑量組給藥47.4 g/（kg·d）。各組大鼠每日給予灌胃1次，正常組和模型對(duì)照組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，持續(xù)4周。

2.2 標(biāo)本制備 各實(shí)驗(yàn)組均在最后1次灌胃后2 h處死，各組1～8號(hào)隨機(jī)抽出3只動(dòng)物用10%水合氯醛麻醉處理，充分暴露心臟后，將灌注針頭插入左心室心尖，剪開右心耳，用生理鹽水快速灌注，待肝臟顏色變淡后換4%多聚甲醛的PBS緩沖液緩慢灌注；迅速剝離腦組織，放入固定皿中0.5 cm、1 cm處冠狀切為前、中、后三段，4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋及冠狀切片 （厚度4～6μm）。

各組剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，放入冰冷生理鹽水中沖洗干凈，冰臺(tái)上迅速分離出大腦兩側(cè)的前額葉皮質(zhì)，放入相應(yīng)編號(hào)的凍存管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 免疫組織化學(xué)法 取常規(guī)前額葉石蠟切片，每組各10張，主要步驟如下：常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，先后加入復(fù)合消化液消化、抗原修復(fù)液修復(fù)、正常山羊血清封閉液封閉，然后滴加ADRα2A一抗，37℃孵育2 h，滴加生物素化二抗，37℃孵育1 h，滴加SABC于37℃放置30 min，采用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。200倍顯微鏡下觀察結(jié)果，以淡黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達(dá)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image-Pro P1us 6.0圖像分析軟件，以平均光密度值（mean density）表示各組ADRα2A蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 Western b1ot法 按每20 mg前額葉皮質(zhì)腦組織加入150～250μL RIAP裂解液與PMSF混合液（比例為100∶1），球磨儀研磨，冰上裂解30min后，4℃下15 000 r/min離心30min，取上清，即為所取組織總蛋白。采用BCA法測(cè)定相應(yīng)蛋白定量并調(diào)平，2×上樣緩沖液混勻后行蛋白變性，-70℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。分別用5%濃縮膠及10%分離膠SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%TBST脫脂奶粉封閉室溫2 h，加入兔源ADRα2A一抗 （1∶500）4℃孵育過夜，羊抗兔二抗 （1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL法顯色，Image Quant LAS 4000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀成像。采用Adobe Photoshop CS5軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示ADRα2A蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析及LSD法兩兩比較，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 免疫組化結(jié)果 免疫組化顯示，模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A陽性黃染顆粒低于正常WKY大鼠，經(jīng)單因素方差分析及LSD法兩兩比較，二者平均光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.035＜0.05）；托莫西汀組、安神定志靈低劑量、中劑量、高劑量組的ADRα2A的陽性表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），且安神定志靈中劑量組的ADRα2A蛋白表達(dá)高于托莫西汀組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.046）。見圖1、表1。

圖1 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白的免疫組化染色（×200）

表1 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A免疫組化陽性表達(dá)水平 （，n=3）

表1 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A免疫組化陽性表達(dá)水平 （，n=3）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與托莫西汀組比較，▲P＜0.05

組別 劑量 平均光密度值（MD） F值 P值正常組 —— 0.080±0.008模型組 —— 0.069±0.004△托莫西汀組 5 mg/（kg·d） 0.080±0.009*中藥低劑量組11.85 g/（kg·d） 0.082±0.008*中藥中劑量組 23.7 g/（kg·d） 0.090±0.012*▲中藥高劑量組47.4 g/（kg·d） 0.082±0.010*3.947 0.007

3.2 Western b1ot結(jié)果 安神定志靈對(duì)ADHD模型SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白表達(dá)的影響，見圖2、表2。ADRα2A/β-actin灰度值比經(jīng)單因素方差分析顯示F= 197.731，P=0.000，可認(rèn)為各組間ADRα2A蛋白表達(dá)水平不全相等。LSD法組間兩兩比較顯示，模型組SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白的表達(dá)明顯低于正常組WKY大鼠（P=0.011）；托莫西汀組的ADRα2A蛋白表達(dá)與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.001），而安神定志靈低劑量、中劑量、高劑量組ADRα2A蛋白表達(dá)水平均顯著優(yōu)于模型組，尤以安神定志靈中劑量組的ADRα2A蛋白表達(dá)最為顯著，與其他各組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.000＜0.01）。

圖2 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白表達(dá)顯影

表2 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白相對(duì)表達(dá)水平 （，n=5）

表2 WKY大鼠、SHR大鼠前額葉皮質(zhì)ADRα2A蛋白相對(duì)表達(dá)水平 （，n=5）

注：與正常組比較，ΔP＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與托莫西汀組比較，▲P＜0.05

組別 劑量 ADRα2A/β-actin灰度值比 F值 P值正常組 —— 0.702±0.018模型組 —— 0.652±0.030△托莫西汀組 5 mg/（kg·d） 0.722±0.007*中藥低劑量組 11.85 g/（kg·d）0.976±0.015*▲中藥中劑量組 23.7 g/（kg·d） 1.065±0.022*▲中藥高劑量組 47.4 g/（kg·d） 0.796±0.023*▲197.731 0.000

4 討論

注意力缺陷多動(dòng)障礙的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，有學(xué)者認(rèn)為ADHD的病理生理與中樞系統(tǒng)去甲腎上腺素的調(diào)節(jié)異常有關(guān)，并提出NE通路的變化可能導(dǎo)致ADHD前額葉環(huán)路的調(diào)節(jié)異常［6］。研究已表明，大腦內(nèi)NE神經(jīng)元可調(diào)節(jié)注意力、學(xué)習(xí)和記憶、情緒、意識(shí)、睡眠-覺醒周期、警覺、焦慮和疼痛等。而ADHD患兒常常存在注意力、學(xué)習(xí)和記憶、睡眠、情緒障礙等癥狀，這也表明NE系統(tǒng)與ADHD的發(fā)病關(guān)系密切。

NE通過不同的受體和信號(hào)通路，調(diào)控前額葉皮質(zhì)的功能，包括α1、α2和β三類腎上腺素受體。NE對(duì)α2受體有高親和性，而對(duì)α1受體和β受體的親和性較低［7］。Ramos等［8］指出前額葉皮質(zhì)α2受體對(duì)活動(dòng)和注意力有重要作用。Arnsten等［9］指出α2腎上腺素受體包括α2A、α2B、α2C三種亞型，α2A和α2C腎上腺素受體分布廣泛，包括前額葉，而α2B腎上腺素受體則在丘腦分布最多。前額葉的工作記憶功能是通過激活α2A腎上腺素受體而改善，如治療ADHD的胍法辛即為選擇性α2A腎上腺素受體激動(dòng)劑［10］。越來越多的研究提出前額葉皮質(zhì)α2A腎上腺素受體功能的低下可能是導(dǎo)致ADHD的病理機(jī)制之一，可作為ADHD的潛在藥物治療靶點(diǎn)［11-12］。

經(jīng)過長期的臨床研究，我們提出 “心肝火旺證”是ADHD主要證型，其發(fā)病機(jī)制主要是心肝火旺，陽亢陰虛，陰陽失衡，神失所藏，魂不守舍，志無所定；其治療以“清心平肝，豁痰開竅，安神定志”為主，以達(dá)到陰平陽秘的治療目的。安神定志靈是針對(duì)ADHD心肝火旺證而設(shè)立的，其組成為：醋柴胡，黃芩，連翹，廣郁金，決明子，天竺黃，石菖蒲，鉤藤 （后下），全當(dāng)歸，生地，益智仁，炙遠(yuǎn)志。方中黃芩、連翹清心瀉火；醋柴胡、廣郁金疏肝解郁散熱；決明子清泄肝火，平潛肝陽，泄熱通便；天竺黃清化無形之痰；鉤藤平肝息風(fēng)止痙；石菖蒲豁痰開竅；當(dāng)歸養(yǎng)血活血，滋潤肝陰，潤腸通便；生地滋補(bǔ)肝腎；益智仁補(bǔ)腎益智；炙遠(yuǎn)志祛痰開竅，寧心安神。諸藥合用共奏清心平肝、豁痰開竅、安神定志之功，使心火得清，肝陽得平，肝腎得補(bǔ)，陰陽得調(diào)，從而消除多動(dòng)、注意力不集中等癥［13］。

本實(shí)驗(yàn)選擇目前臨床療效確切的非中樞興奮藥托莫西汀作為藥物對(duì)照，Bymaster等［14］提出其作用機(jī)制是通過選擇性抑制去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體，提高突觸間隙NE水平來發(fā)揮治療作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組SHR大鼠前額葉皮質(zhì)α2A腎上腺素受體蛋白表達(dá)明顯低于正常對(duì)照WKY大鼠，說明α2A腎上腺素受體與ADHD發(fā)病有關(guān)。而托莫西汀、安神定志靈低、中、高劑量均可以顯著上調(diào)α2A腎上腺素受體蛋白表達(dá)水平，且中劑量α2A腎上腺素受體蛋白表達(dá)水平高于托莫西汀，說明前額葉皮質(zhì)α2A腎上腺素受體可能是安神定志靈的作用靶點(diǎn)之一。

［1］Po1anczyk G，de Lima M S，Horta B L，et al.The wor1dwide preva1ence of ADHD：a systematic review and metaregression ana1ysis［J］.Am JPsychiatry，2007，164（6）：942-948.

［2］韓新民，朱先康.安神定志靈治療兒童多動(dòng)癥58例臨床觀察［J］.河北中醫(yī)，2004，26（12）：898-899.

［3］劉成全，韓新民，徐建亞，等.安神定志靈對(duì)ADHD模型大鼠紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（23）：101-104.

［4］劉成全，韓新民，徐建亞，等.安神定志靈對(duì)ADHD模型鼠前額葉皮質(zhì)和紋狀體多巴胺D1、D2受體表達(dá)的影響［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（7）：136-139.

［5］Sagvo1den T，Russe11V A，Aase H，et al.Rodentmode1s of attention-deficit/hyperactivity disorder［J］.Biol Psychiatry，2005，57（11）：1239-1247.

［6］Kim B N，Kim JW，Kang H，etal.Regiona1differences in cerebra1perfusion associated with the a1pha-2A-adrenergic receptor genotypes in attention deficithyperactivity disorder［J］.Psychiatry Neurosci，2010，35（5）：330-336.

［7］Arnsten A F.Through the 1ooking g1ass：Differentia1noradenergicmodu1ation of prefronta1cortica1 function［J］.Neural Plast，2000，7（1-2）：133-146.

［8］Ramos BP，Arnsten A F.Adrenergic pharmaco1ogy and cognition：Focus on the prefronta1 cortex［J］.Pharmacol Ther，2007，113（3）：523-536.

［9］Arnsten A F，Scahi11L，F(xiàn)ind1ing R L.A1pha2-Adrenergic receptor agonists for the treatmentof attention-deficit/hyperactivity disorder：emerging concepts from new data［J］.JChild Adolesc Psychopharmacol，2007，17（4）：393-406.

［10］Kim S，Bobeica I，Gamo N J，et al.Effects ofα-2A adrenergic receptor agonist on time and risk preference in primates［J］. Psychopharmacology，2012，219（2）：363-375.

［11］金國章.腦內(nèi)多巴胺［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2010：595.

［12］Gyires K，Zádori ZS，T?r?k T，etal.A1pha（2）-Adrenoceptor subtypes-mediated physio1ogica1，pharmaco1ogica1 actions［J］.Neurochem Int，2009，55（7）：447-453.

［13］劉成全.韓新民從心肝火旺論治兒童多動(dòng)癥的經(jīng)驗(yàn)［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2007，19（3）：211-212.

［14］Bymaster F P，Katner JS，Ne1son D L，et al.Atomoxetine increases extrace11u1ar 1eve1s of norepinephrine and dopamine in prefronta1 cortex of rat：A potentia1mechanism for efficacy in attention deficit/hyperactivity disorder［J］.Neuropsychopharmacology，2002，27（5）：699-711.

R285.5

B

1001-1528（2015）08-1832-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.045

2014-04-12

國家級(jí)重點(diǎn)學(xué)科南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)科第二期開放研究課題 （EZK2012009）；江蘇省2012年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXZZ12-0613）

雷 爽 （1986—），女，醫(yī)學(xué)博士，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治小兒神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病。Te1：（025）86617141，E-mai1：1eishuanghaohao@126.com

*通信作者：韓新民 （1957—），男，教授，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治小兒神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病。Te1：（025）86798182，E-mai1：hxm1nj@163.com