丹參根部直徑與其活性成分含有量間的相關(guān)性研究

尉廣飛， 李 翠， 劉 謙， 李 佳， 張永清

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355）

丹參根部直徑與其活性成分含有量間的相關(guān)性研究

尉廣飛， 李 翠， 劉 謙， 李 佳， 張永清*

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南250355）

目的探討丹參根部直徑大小與其活性成分含有量間的相關(guān)性。方法HPLC法測定4個平均直徑 （1.366、1.085、0.808和0.360 cm）丹參根中的脂溶性成分 （隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA）和水溶性成分 （丹酚酸B和迷迭香酸）含有量，然后進行統(tǒng)計分析。結(jié)果直徑最小的丹參根中迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ和隱丹參酮的含有量分別是直徑最大的150%、193.71%、533.33%，200%和377.78%。結(jié)論丹參加工時不應(yīng)將細條及須根丟棄。

丹參；根；直徑；隱丹參酮；丹參酮Ⅰ；丹參酮ⅡA；丹酚酸B；迷迭香酸；相關(guān)性

丹參Salvia miltiorrhiz a Bge為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，具有重要的藥用價值，其干燥根及根莖即為傳統(tǒng)中藥丹參，可祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩，用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕積聚、胸腹刺痛、熱痹疼痛、瘡瘍腫痛、心煩不眠等病癥。現(xiàn)代研究證明，其活性成分分為兩大類，一是水溶性成分，包括丹參素、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸D和丹酚酸E等；二是脂溶性成分，包括隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA等，具有抗心律失常、保護血管內(nèi)皮細胞、減輕缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、保肝及抗肝纖維化等藥理活性［1］。由于丹參藥材市場需求量非常大，目前主要依靠人工栽培以滿足需要，在河南、山東、陜西、河北等省區(qū)均有大面積種植。傳統(tǒng)經(jīng)驗認為，丹參藥材 “以條粗、內(nèi)紫黑色，有菊花狀白點者為佳”，生產(chǎn)中常常將細條及須根丟棄。究竟丹參藥材條粗好，還是條細好，這不僅影響丹參良種選育目標(biāo)的確定，也影響施肥、澆水等具體栽培措施的進行，亟需予以解決，但有關(guān)丹參藥材研究目前多集中在種質(zhì)［2］、產(chǎn)地［3-4］、加工貯藏［5-6］等方面。劉先瓊等［7］分析了不同直徑丹參中丹參酮ⅡA的含有量，發(fā)現(xiàn)直徑越小，丹參酮ⅡA含有量越高，但未考察水溶性成分含有量是否與丹參直徑有關(guān)。本實驗根據(jù)根部直徑，將丹參藥材分為不同的類別，分別測定了脂溶性和水溶性兩大類成分，以期為丹參藥材合理分級及規(guī)范化種植標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料 2013年10月20日收集河南省靈寶市陽店鎮(zhèn)羊角寨村藥材基地種植的丹參植株，系2012年8月育苗，2013年春季移栽植株，盡量保持根段不折斷，收刨面積為500 m2，截取長30 cm根段，測定其最粗部位直徑。然后，根據(jù)直徑大小，將丹參根段分為4個級別。1級，直徑最大，平均直徑為1.366 cm；2級，直徑較大，平均直徑為1.085 cm；3級，直徑較小，平均直徑為0.808 cm；4級，直徑最小，平均直徑為0.360 cm，統(tǒng)一曬干 （保持干燥條件一致）。在干燥后的各級別丹參根段中，隨機抽取20支，粉碎，置干燥器中備用，各級別平行實驗3次。所用藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定，確認為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根部。

1.2 儀器 Ag1ient 1260高效液相色譜儀，包括G1311C四元高壓梯度泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器、Chem Station色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Ag1ient公司）；CP225D型精密電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速多功能粉碎機 （25 000 r/min，上海樹立儀器儀表有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗設(shè)備有限公司）。

1.3 試劑 迷迭香酸 （批號20120809）、丹酚酸B（批號 PA0418RA13）、丹參酮ⅡA（批號20130111），購自上海源葉生物科技有限公司；丹參酮Ⅰ （批號110867-200406）和隱丹參酮 （批號110852-200806），購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇 （分析純）、磷酸 （優(yōu)級純）、乙腈 （優(yōu)級純），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；純凈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司。

2 方法

2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取減壓干燥至恒定質(zhì)量的脂溶性對照品丹參酮ⅡA 0.93 mg、丹參酮Ⅰ0.94 mg、隱丹參酮1.07 mg，置于50 mL棕色量瓶中，甲醇溶解后定容，然后稀釋10倍，質(zhì)量濃度分別為1.86、1.88、2.74μg/m L。再分別精密稱取水溶性對照品迷迭香酸0.2 mg和丹酚酸B 2.12 mg，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解后定容，質(zhì)量濃度分別為20和212μg/mL，即得。

2.2 樣品溶液制備

2.2.1 水溶性成分 準(zhǔn)確稱取丹參粉末0.5 g，置于磨口錐形瓶中，加入75%甲醇50 m L，50℃下超聲提取40 min，取出放冷，用75%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用微孔濾膜 （0.45 μm）濾過，即得。

2.2.2 脂溶性成分 準(zhǔn)確稱取丹參粉末0.5 g，置于磨口錐形瓶中，加入甲醇50mL，50℃下超聲提取40 min，取出放冷，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，即得。

2.3 色譜條件

2.3.1 水溶性成分 Diamonsi1 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫30℃；波長286 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量10μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.026%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～15 min，17%～23%A；15～30 min，23%～25%A；30～40 min，25%～90%A；40～50 min，90%A）。理論塔板數(shù)按丹酚酸B計，不低于3 000。

2.3.2 脂溶性成分 Diamonsi1 C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm）；柱溫25℃；波長270 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量10μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.026%磷酸水溶液，梯度洗脫 （0～20min，20%～60%A；20～50 min，60%～80% A）。理論塔板數(shù)按丹參酮ⅡA計，不低于3 000。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 按照 “2.1”項下方法，配制不同質(zhì)量濃度的各對照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，以對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣量為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 丹參各活性成分對照品回歸方程Tab.1 Regression equation of each active ingredient reference substance of Danshen

2.4.2 精密度試驗 取同一供試品溶液適量，連續(xù)進樣6次，每次10μL，測定迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的峰面積。結(jié)果，RSD值均小于1.5%，說明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 將同一供試品溶液在室溫下放置，分別于0、2、6、12、18、24 h后各進樣1次，每次10μL。結(jié)果，迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA峰面積的RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批丹參樣品6份，按上述供試液的制備方法制備樣品，按選定的色譜條件測定，計算迷迭香酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA含有量。結(jié)果，RSD值均小于2.0%，表明重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗 精密稱定各成分含有量已知的1級丹參根段粉末樣品0.5 g，加入對照品溶液，按 “2.2”項方法制備樣品溶液，測定結(jié)果見表2，表明回收率良好。

表2 加樣回收試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

3 結(jié)果與分析

3.1 不同直徑丹參水溶性活性成分 分別精密吸取對照品與供試品水溶性溶液10μL，在 “2.3.1”項色譜條件下進行分析，丹參水溶性成分混合對照品及其樣品的HPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 丹參水溶性成分混合對照品和樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of water-solublem ixed reference substances and sam p le of Danshen

然后，測定各吸收峰峰面積，外標(biāo)法計算水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B的含有量，測定結(jié)果見圖2，二者總含有量的測定結(jié)果見圖3。

圖2 不同直徑丹參根部丹酚酸B和迷迭香酸的含有量Fig.2 Contents of Sal B and nosmarinic acid in Danshen roots w ith differen t diameters

圖3 不同直徑丹參根部水溶性成分的總含有量Fig.3 Total contents of w ater-soluble constituents in Danshen rootswith different diameters

圖2、圖3結(jié)果顯示，丹參根部的丹酚酸B迷迭香酸含有量以直徑最大的1級最低，分別為1.75%、0.06%，而直徑最小的4級最大，分別達3.39%、0.09%，呈現(xiàn)出隨根部直徑增加而降低的趨勢。在兩種水溶性成分中，丹酚酸B含有量的變化更為明顯，并且兩種水溶性成分的總含有量也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，1級根的總含有量為1.81%，而4級根為3.48%。

3.2 不同直徑丹參根部脂溶性成分 分別精密吸取脂溶性成分對照品與供試品溶液各10μL，在“2.3.2”項色譜條件下進行分析，丹參脂溶性成分混合對照品及其樣品的HPLC色譜圖如圖4所示。

圖4 丹參脂溶性成分混合對照品和樣品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of fat-soluble m ixed reference substances and sam p le of Danshen

然后，測定各吸收峰峰面積，外標(biāo)法計算脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的含有量，測定結(jié)果見圖5，三者總含有量的測定結(jié)果見圖6。

圖5 不同直徑丹參樣品脂溶性成分的含有量Fig.5 Contents of fat-soluble constituents in Danshen rootswith different diam ters

圖6 不同直徑丹參樣品脂溶性成分的總含有量Fig.6 Total conten ts of fat-soluble constituen ts in Danshen rootswith different diam ters

圖5和圖6結(jié)果顯示，丹參根部的丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ含有量均以直徑最大的1級最低，直徑最小的4級最高。其中，1級根中丹參酮ⅡA、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的含有量分別為0.09%、0.09%、0.03%，4級根中的含有量分別為0.48%、0.34%、0.06%，顯示出隨丹參直徑增大而不斷降低的趨勢，其中以丹參酮ⅡA含有量變化最為明顯。而且，這3種脂溶性成分的總含有量也表現(xiàn)出相同的變化趨勢，1級根為0.21%，而4級根為0.88%。

4 討論與小結(jié)

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，丹參根部各種活性成分含有量與直徑間均具有明顯負相關(guān)，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹酚酸B、丹參酮ⅡA的相關(guān)系數(shù)r均大于0.8，相關(guān)性較強，而迷迭香酸r在0.6～0.8之間，為中度相關(guān)。說明丹參根部直徑越大，無論是脂溶性還是水溶性成分的含有量均越低，藥材內(nèi)在質(zhì)量越差，這與 “根粗質(zhì)優(yōu)”的傳統(tǒng)經(jīng)驗不符，從而為丹參藥材質(zhì)量評價與分級提供了新的依據(jù)。

植物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)的形成與積累往往集中在一些特定的組織或細胞中。丹參體內(nèi)的丹酚酸B、迷迭香酸、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA均屬于次生物質(zhì)，它們的生物合成與積累也會集中在特定的組織或細胞中，但具體部位目前尚不明確［8-12］。一般來講，生理代謝活動越旺盛的組織或細胞次生代謝越旺盛，次生物質(zhì)含有量也就越高。丹參屬于多年生草本植物，其根部會通過形成層產(chǎn)生次生生長，向外產(chǎn)生韌皮部，向內(nèi)產(chǎn)生木質(zhì)部，韌皮部的代謝活動一般較木質(zhì)部為強，其次生代謝物質(zhì)含有量也就往往較高。不同直徑丹參根部各種活性成分的含有量差異與其內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。根部越粗，韌皮部在根中所占比例越小；根部越細，韌皮部在根中所占比例越高，這可能就是根越粗，活性成分含有量越低的原因。

丹參細根中也含有較多的活性成分，具有重要的藥用價值，過去往往廢棄不用，是很大的損失，同時也造成了環(huán)境污染［13］。細根雖然用于生產(chǎn)飲片時外觀質(zhì)量不高，但可作為原料用于提取丹參酮ⅡA、丹酚酸B等活性成分，從而可以節(jié)約植物資源，創(chuàng)造較高的經(jīng)濟價值。

種質(zhì)不同，丹參植株根部的形態(tài)特征也有明顯差異，有的主根粗大，但分支較少；有的主根不明顯，側(cè)根較多。因此，可以通過品種選育，選擇根粗一般、產(chǎn)量較高、活性成分含有量較高的新品種，以提高活性成分收率，用于中成藥生產(chǎn)；也可選擇主根粗大及側(cè)根較少的品種，用于飲片加工生產(chǎn)。

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Correlation of Danshen root diam eters and their active constituent contents

WEIGuang-fei， LICui， LIU Qian， LI Jia， ZHANG Yong-qing*

（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

AIMTo exp1ore the corre1ation between Danshen（Salvia Miltiorrhiza）root diameters and their active constituent contents.METHODSHPLCmethod was used to determine the contents of fat-so1ub1e（cryptotanshinone，tanshinoneⅠand tanshinoneⅡA）and water-so1ub1e constituents（Sa1 B and rosmarinic acid）in Tanshen roots with 4 average diameters，then the statistica1 ana1ysis wasmade.RESULTSActive constituent contents in Danshen with the sma11est root diameterswere higher than the 1argest，the contents of rosmarinic acid，Sa1B，tanshinoneⅡA，tanshinoneⅠand cryptotanshinone in the sma11est diameter were 150%，193.71%，533.33%，200%and 377.78%compared with the 1argest diameter，respective1y.CONCLUSIONWhen processing Danshen，its shreds and fibrous roots shou1d not be discarded.

Danshen（Salvia miltiorrhiza）；root；diameters；cryptotanshinone；tanshinoneⅠ；tanshinoneⅡA；Sa1B；rosmarinic acid；corre1ation

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1780-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.032

2014-10-31

山東省科技發(fā)展計劃項目 （2008GG2NS02022）；國家科技重大專項 （2012ZX09034006）

尉廣飛 （1986—），女，碩士，研究方向為中藥資源及其質(zhì)量控制。E-mai1：874101744@qq.com

*通信作者：張永清 （1962—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥資源及其質(zhì)量控制研究。E-mai1：zyq622003@126.com