RP-HPLC法測定逍遙丸 （水丸）中芍藥苷、苯甲酸和苯甲酰基總苷

李向陽， 高 潔， 屠萬倩， 楊明杰

（1.河南省食品藥品檢驗所，河南鄭州450003；2.鄭州鐵路職工技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450052；3.河南省中醫(yī)藥研究院，河南鄭州450004；4.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008）

RP-HPLC法測定逍遙丸 （水丸）中芍藥苷、苯甲酸和苯甲酰基總苷

李向陽1， 高 潔2， 屠萬倩3， 楊明杰4

（1.河南省食品藥品檢驗所，河南鄭州450003；2.鄭州鐵路職工技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450052；3.河南省中醫(yī)藥研究院，河南鄭州450004；4.河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008）

目的建立反相高效液相色譜法定量測定8家企業(yè)生產(chǎn)的逍遙丸中芍藥苷、游離苯甲酸和苯甲酰基總苷。方法逍遙丸甲醇提取液分析采用Agi1ent Ec1ipse XDBC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），測定芍藥苷和苯甲酸的流動相為乙腈 （A）-0.1%磷酸溶液 （B），梯度洗脫；苯甲?；傑找钥傑諌A水解為苯甲酸計算，色譜條件同上。結(jié)果芍藥苷和游離苯甲酸進樣量分別在0.060 8～0.760μg（r=0.999 8）、0.009 6～0.120 0μg（r=0.999 7）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率 （n=6）為97.3% （RSD=2.2%）和97.2% （RSD=2.2%）；苯甲?；傑赵?.020 32～0.304 8μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 （r=0.999 6），平均回收率 （n=6）為96.6% （RSD=2.8%）。結(jié)論建議增加苯甲?；傑盏亩繙y定可有助于更好地控制逍遙丸的內(nèi)在質(zhì)量。

逍遙丸；芍藥苷；苯甲酸；苯甲?；傑?；反相高效液相色譜法

逍遙丸 （水丸）是 《中國藥典》2010年版一部收載的常用復(fù)方中藥，由柴胡、當歸、白芍、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草和薄荷七味中藥組成，具有疏肝健脾、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)的功效，用于肝郁脾虛所致的郁悶不舒、胸脅脹痛、頭暈?zāi)垦?、食欲減退、月經(jīng)不調(diào)等癥的治療［1］。隨著逍遙丸的臨床應(yīng)用和藥理作用研究的深入，其主治病癥不斷擴大，現(xiàn)已被應(yīng)用于抑郁癥、圍絕經(jīng)期綜合癥、乳腺增生癥、慢性肝炎、腸易激綜合癥、慢性前列腺炎等多種疾病的治療［2］。

白芍是逍遙丸 （水丸）中起養(yǎng)血柔肝作用的重要藥物。白芍主要含有芍藥苷、苯甲酰羥基芍藥苷、芍藥苷元酮、氧化芍藥苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、羥基苯甲酰芍藥苷、白芍苷R1、乙酰芍藥苷、4-O-沒食子酰白芍苷、沒食子酰芍藥苷、沒食子酸及苯甲酸等多種單萜及苷類成分［3-4］。白芍苷類成分具有降脂、抗氧化、抗炎、對肝損傷的保護作用和調(diào)節(jié)免疫等多種作用，是逍遙丸 （水丸）中的重要活性部位［5-8］。據(jù)文獻報道白芍的主要質(zhì)控成分為芍藥苷，但研究發(fā)現(xiàn)以芍藥苷單一指標的質(zhì)控模式不能準確反映藥材內(nèi)在質(zhì)量［9］，因此，已有研究報道以多種苷類單體為定量指標，控制白芍藥材質(zhì)量［10-11］，或根據(jù)白芍中苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)多含有苯甲酰基、可水解為苯甲酸的特性，將白芍飲片及提取物水解后測定總苷的量［12～14］。在現(xiàn)行逍遙丸 （水丸） 的質(zhì)量標準中用芍藥苷作為定量指標，不能全面反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量?？紤]到白芍中含有多種苯甲?；疹惓煞郑蓪⑵渌鉃楸郊姿?，HPLC法測定水解后苯甲酸的總量，減去游離苯甲酸量，即可反映出藥品中苯甲?；疹惓煞值暮辛俊闇蚀_測定并計算出逍遙丸 （水丸）中苯甲?；傑盏牧浚瑧?yīng)測定樣品中游離的苯甲酸量，同時考慮到白芍中所含游離的苯甲酸是白芍中的無效成分，且會增加肝臟解毒負擔(dān)，長期攝入一定量后產(chǎn)生不良反應(yīng)，一般被視為白芍中的有害成分，其在藥品中的含有量也應(yīng)予以檢測和控制［15-16］。為確保臨床用藥的安全有效性，采用反相高效液相色譜法，分別測定了不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的多批次逍遙丸 （水丸）中芍藥苷、游離苯甲酸及苯甲酰基總苷 （以苯甲酸計）的量。

1 儀器與試藥

日本島津LC2010高效液相色譜儀；ASS150超聲波提取器 （濟寧科特超聲電子有限責(zé)任公司）；LIBROR-160DPT萬分之一分析天平（日本島津）；AE240十萬分之一分析天平（瑞士METTLER公司）。

芍藥苷對照品 （批號110736-201035）、苯甲酸對照品 （批號100419-200801）均購自中國藥品生物制品檢定所；逍遙丸 （水丸）（山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號分別為20100401、20120101、20120301；亞寶藥業(yè)大同制藥有限公司，批號20100504；四川和潤制藥有限公司，批號120203；承德頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司，批號100610；赤峰丹龍藥業(yè)有限公司，批號20100415；山西開元制藥有限公司，批號20100101，20100602；寧夏啟元國藥有限公司，批號090515；廣西來賓金錢草藥業(yè)有限公司，批號090902，090903）；甲醇、乙腈為色譜純 （德國Merck公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷和游離苯甲酸測定

2.1.1 色譜條件 Agi1ent Ec1ipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～15 min，15%A；15～18 min，15%→25%A；18～33 min，25%A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進樣量10μL；檢測波長230 nm。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷和苯甲酸對照品，加甲醇制成每1 mL分別含芍藥苷30.4μg、苯甲酸4.8μg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 m L，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性對照試驗 按處方比例，制備缺白芍陰性對照藥，按 “2.1.3”項下方法操作，制備缺白芍陰性樣品溶液。分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按 “2.1.1”項下色譜條件進行檢測，色譜圖見圖1。供試品色譜中，可清晰檢出芍藥苷和苯甲酸色譜峰，缺白芍陰性對照無干擾。

圖1 芍藥苷和游離苯甲酸測定HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of paeoniflorin and benzoic acid

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.1.2”項下的對照品溶液2、5、10、15、20、25μL，分別注入液相色譜儀，測定。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，得芍藥苷和苯甲酸的回歸方程分別為Y=1.106×106X+ 1.007×103（r=0.999 8），Y=6.061×106X-5.378×103（r=0.999 7）。結(jié)果表明芍藥苷在0.060 8～0.760μg、苯甲酸在0.009 6～0.120 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定芍藥苷和苯甲酸的峰面積并計算RSD值，結(jié)果芍藥苷和苯甲酸的RSD值分別為0.85%和1.3%。表明儀器精密度較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h注入液相色譜儀，測定芍藥苷和苯甲酸的峰面積并計算RSD值，結(jié)果芍藥苷和苯甲酸的RSD值分別為1.1%和1.4%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取逍遙丸 （批號120203），按 “2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。芍藥苷和苯甲酸的平均含有量分別為6.434 mg/g和1.008 mg/g，RSD值分別為1.7%和1.3%，表明本法重復(fù)性較好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知含有量的逍遙丸（批號120203）0.2 g，精密稱定，精密加入芍藥苷為0.028 8 mg/mL、苯甲酸為0.004 0 mg/mL的對照品混合溶液50 m L，以下按 “2.1.3”項下操作，制備加樣供試品溶液。按 “2.1.1”項下方法測定分析，計算芍藥苷和苯甲酸的加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.1.10 樣品測定 取逍遙丸樣品，按 “2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按 “2.1.1”項下方法測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Resu lts of determ ination

2.2 苯甲?；傑?（以苯甲酸計）測定

2.2.1 色譜條件 同 “2.1.1”項下方法。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取苯甲酸對照品適量，加甲醇制成每1mL含苯甲酸10.16μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣加1%氫氧化鈉溶液10 mL溶解，置具塞試管中，水浴加熱1 h，放冷，精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加流動相8mL，搖勻，用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH為3～4，用流動相稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 陰性對照試驗 按處方比例，制備缺白芍陰性對照樣品，按 “2.2.3”項下方法操作，制備缺白芍陰性樣品溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按 “2.1.1”項下色譜條件進行檢測，色譜圖見圖2。供試品色譜中，可清晰檢出苯甲酸色譜峰，缺白芍陰性對照無干擾。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2.2”項下的對照品溶液2、5、10、15、20、30μL，分別注入液相色譜儀，測定。以進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=5.625×106X-6.171×103（r= 0.999 6）。表明苯甲酸在0.020 32～0.304 8μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖2 苯甲?；傑諟y定HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of total benzoy l glucosides

2.2.6 精密度試驗 吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定苯甲酸的峰面積并計算RSD值，結(jié)果苯甲酸的RSD值為1.1%。表明儀器精密度較好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h注入液相色譜儀，測定苯甲酸的峰面積并計算RSD值，結(jié)果苯甲酸的RSD值為1.1%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取逍遙丸 （批號120203），按 “2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按 “2.1.1”項下色譜條件進行測定總苯甲酸的量，減去已測定的游離苯甲酸的量，計算苯甲酸的量，即為苯甲?；傑?（以苯甲酸計）的量。結(jié)果平均含有量和RSD值分別為4.631 mg/g和2.8%，表明本法重復(fù)性較好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含有量的逍遙丸（批號120203），取約0.5 g，精密稱定，精密加入0.043 6 mg/m L的苯甲酸對照品溶液50 mL，以下按 “2.2.3”項下操作，制備加樣供試品溶液。按“2.1.1”項下方法測定分析，計算苯甲酸的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.10 樣品測定 取逍遙丸樣品，按 “2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按 “2.1.1”項下方法測定，測定總苯甲酸量，減去游離苯甲酸量后，計算苯甲?；傑?（以苯甲酸計）的量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 測定指標的確定 逍遙丸 （水丸）由柴胡、白芍等七味藥制成，現(xiàn)行質(zhì)量標準中僅以白芍中的芍藥苷單體成分為指標進行定量控制，顯然不夠科學(xué)，不能全面反映藥品內(nèi)在質(zhì)量?？紤]到白芍中含有多種苯甲酰基苷類成分，是逍遙丸 （水丸）中重要的生物活性成分，將逍遙丸水解后測定苯甲酸總量，扣除游離苯甲酸量，以反映藥物中苯甲?；傑盏牧浚Y(jié)合芍藥苷單體的測定，可以更好地控制藥品中白芍苷類成分的量。另外，由測定結(jié)果可知，多廠家生產(chǎn)的逍遙丸 （水丸）中可檢出具有毒副作用的游離苯甲酸，為確保臨床用藥的安全性，應(yīng)在逍遙丸 （水丸）質(zhì)量標準中增加相應(yīng)的檢測方法，控制苯甲酸的量。因此，本實驗測定了逍遙丸 （水丸）中芍藥苷、游離苯甲酸和苯甲?；傑?（以苯甲酸計）的量。

3.2 流動相的優(yōu)選 據(jù)參考文獻，采用HPLC法測定總苯甲酸、游離苯甲酸和芍藥苷含有量。在試驗中，摸索了流動相配比，為簡化實驗操作，用甲醇超聲處理供試品，采用梯度洗脫法同時測定了供試品中的芍藥苷和游離苯甲酸；樣品水解后，采用相同的色譜條件測定苯甲酸總量。按照文中方法，待測成分均峰形對稱，與相鄰峰可達較好的分離度，確保了測定的準確。

3.3 供試品溶液的制備 根據(jù)芍藥苷和游離苯甲酸的理化性質(zhì)，用甲醇超聲提取制備供試品溶液。在實驗中，分別對超聲時間、甲醇加入量等因素進行了考察和比較，根據(jù)實驗結(jié)果，確定了芍藥苷和游離苯甲酸測定的供試品溶液的制備方法。根據(jù)苯甲酰基總苷的理化性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)特點，采用甲醇超聲提取，堿水加熱水解的方法制備總苷中苯甲酸測定用供試品溶液。在實驗中，分別比較了氫氧化鈉溶液的濃度、加入量、加熱水解時間等參數(shù)，根據(jù)實驗結(jié)果，確定了樣品中苯甲酰基總苷供試品溶液的制備方法。

3.4 小結(jié) 本實驗采用高效液相色譜法測定了8個廠家生產(chǎn)的12批次逍遙丸 （水丸）中芍藥苷、苯甲酸和苯甲?；傑?（以苯甲酸計）的量，結(jié)果所有批次樣品中芍藥苷含有量均符合 《中國藥典》2010年版一部逍遙丸 （水丸）項下芍藥苷量不得低于2.5 mg/g的有關(guān)規(guī)定。除2批次樣品中游離苯甲酸量過低無法準確定量外，10批樣品中均檢出游離的有害成分苯甲酸，建議今后應(yīng)在逍遙丸 （水丸）的質(zhì)量評價方法中增加相關(guān)項目檢測，保證臨床用藥的安全性。同時，不同廠家和批次的樣品中苯甲酰基總苷測定結(jié)果差異較大，芍藥苷單體的含有量與苯甲?；傑蘸辛繜o明顯相關(guān)性，提示苯甲?；傑盏暮辛坎町惪赡芘c樣品中所含除芍藥苷外的其他苷類成分有關(guān)，增加苯甲酰基總苷的定量測定可有助于更好地控制逍遙丸的內(nèi)在質(zhì)量。本實驗所建立方法操作簡便，重復(fù)性好，豐富了逍遙丸 （水丸）的定量質(zhì)控手段，可為該藥物的全面質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：995-996.

［2］夏小玉，邵 輝，沈紅薇，等.逍遙丸的臨床研究進展［J］.陜西中醫(yī)，2011，26（9）：1436-1437.

［3］吳 芳，杜偉鋒，徐珊珊，等.白芍化學(xué)成分及質(zhì)量評價方法研究進展［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，36（5）：613-615.

［4］譚菁菁，趙慶春，楊 琳，等.白芍化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2010，41（8）：1245-1248.

［5］劉月華，呂俊華.白芍總苷的降血脂、抗氧化作用及對脂肪肝的防治研究［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，18（2）：158-161.

［6］李宜川，劉國玲，張玉霞，等.白芍總苷對NAFLD大鼠肝臟NF-κB/p65蛋白表達及羥脯氨酸含量的影響［J］.聊城大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，24（4）：62-66.

［7］馮文林，伍海濤，羅超華.白芍總苷在消化系統(tǒng)疾病中的藥理研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（7）：1778-1779.

［8］李冰菲，王 娟，張碧麗.白芍總苷治療腎臟疾病的藥理作用和臨床應(yīng)用研究進展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28（5）：811-814.

［9］杜偉鋒，胡淑珍，吳 芳，等.不同級別杭白芍中3個有效成分的考察［J］.中成藥，2014，36（2）：358-362.

［10］李偉銘，趙月然，楊燕云，等.HPLC波長切換法同時測定白芍飲片中9個成分的含量［J］.藥物分析雜志，2011，31（12）：2208-2212.

［11］鄭敏霞，陳 喆，劉 培，等.白芍中芍藥苷及其衍生物的UPLC-MS/MS分析［J］.中國中藥雜志，2011，36（12）：1641-1643.

［12］劉敏彥，高秀強，王 永，等.高效液相色譜法測定白芍藥材中白芍總苷的含量［J］.中國藥業(yè)，2008，17（5）：22-23.

［13］劉玉紅，陳 燕，易進海.HPLC測定白芍總苷的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2002，17（4）：295-296.

［14］瞿白露，禹文峰，任鳳蓮，等.基于堿水解反應(yīng)-熒光光度法測定白芍總苷的含量［J］.理化檢驗：化學(xué)分冊，2010，46（9）：1040-1042.

［15］陳科敏，吳巧鳳.杭白芍和亳白芍中苯甲酸的含量測定［J］.中草藥，2004，35（9）：1064.

［16］李越峰，嚴興科.赤芍和白芍不同部位芍藥苷和苯甲酸的含量分析研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（3）：519-520.

Determ ination of paeoniflorin，benzoic acid and total benzoyl glucosides in Xiaoyao Pills by RP-HPLC

LIXiang-yang1， GAO Jie2， TUWan-qian3， YANGMing-jie4

（1.Henan Institute of Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China；Zhengzhou Kailway Vocational and Technical College，Zhengzhou 450052，China；3.Henan Academy of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450004，China；4.Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

AIMTo estab1ish an HPLC method for determining the contents of paeonif1orin，free benzoic acid，and tota1benzoy1g1ucosides（with benzoic acid as contro1）in Xiaoyao（water）Pi11s produced by eightmanufactories.METHODSThe ana1ysis of Xiaoyao Pi11smethano1ic extractwas performed on Agi1ent Ec1ipse XDB C18co1umn（4.6 mm×250 mm，5μm）.The mobi1e phase for simu1taneous determining paeonif1orin and benzoic consisted of acetonitri1e（A）-0.4%phosphoric acid（B）in gradient e1ution mode at the f1ow rate of 1.0 m L/min.The detection wave1ength was set at 230 nm.Using the method of a1ka1ine hydro1ysis，the tota1benzoy1 g1ucosides in Xiaoyao Pi11swere hydro1yzed into benzoic acid，determined by HPLC，and ca1cu1ated as benzoic acid content.The chromatographic conditionswere the same as the above.RESULTSThe 1inear ranges of paeonif1orin and free benzoic acid were in the ranges of0.060 8-0.760μg（r=0.999 8）and 0.009 6-0.120 0μg（r= 0.999 7），respective1y.The average recovery rates（n=6）were97.3%（RSD=2.2%）and 97.2%（RSD= 2.2%），respective1y.The 1inear range of benzoy1g1ucosides was in the ranges of 0.020 32-0.304 8μg（r=0.999 6），and the average recovery rate（n=6）was 96.6%（RSD=2.8%）.CONCLUSIONThemethod is simp1e，accurate and sensitive，and can be used for the qua1ity contro1of Xiaoyao Pi11s.

Xiaoyao Pi11s；paeonif1orin；benzoic acids；benzoy1g1ucosides；RP-HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）08-1722-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.019

2014-08-25

李向陽（1968—），男，副主任藥師，主要從事藥品檢驗、中藥質(zhì)量分析研究。Te1：（0371）63388283，E-mai1：1ixia632@126.com