HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定理沖生髓飲中7種親脂性成分

王艷宏， 尚冬雪， 李 洋， 趙永偉， 張 艷， 韓鳳娟*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040）

［質(zhì) 量］

HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定理沖生髓飲中7種親脂性成分

王艷宏1， 尚冬雪1， 李 洋1， 趙永偉1， 張 艷2， 韓鳳娟2*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040）

目的建立RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定理沖生髓飲中親脂性成分的分析方法。方法理沖生髓飲超臨界萃取，HPLC法分析采用Dikma Diamonsi1-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以0.1%磷酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，體積流量為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯分別在0.16～8.14μg/mL、0.27～13.44μg/mL、0.10～4.98μg/mL、0.18～9.10μg/mL、0.08～4.06μg/mL、0.21～10.59μg/mL、0.28～14.18μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。平均加樣回收率在96.76%～100.38%之間。結(jié)論本方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定理沖生髓飲7種親脂性成分。

理沖生髓飲；姜黃素；莪術(shù)醇；牻牛兒酮；莪術(shù)二酮；呋喃二烯；β-欖香烯；亞油酸

理沖生髓飲是國(guó)家老中醫(yī)、黑龍江省名中醫(yī)王秀霞教授在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上總結(jié)而成的中藥復(fù)方制劑，由莪術(shù)、三棱、黃芪、鹿茸等八味中藥組成，具破血消癥、軟堅(jiān)散結(jié)、補(bǔ)氣養(yǎng)血、填精益髓之功，對(duì)卵巢癌的治療有獨(dú)特的療效［1］?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明其既可以阻斷Bc1-2癌基因蛋白的表達(dá)［2］，又能夠降低卵巢腫瘤細(xì)胞的PCNA和P53基因的表達(dá)［3］，通過調(diào)節(jié)癌基因信號(hào)傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞增殖［4］，進(jìn)而抑制血管生成，在提高機(jī)體免疫的同時(shí)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［5-7］。姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、β-欖香烯是莪術(shù)的主要成分，具有消炎、抗血栓、抗腫瘤、抗菌抗病毒等多種藥理活性［8-12］。亞油酸是黃芪、鹿茸等均含有的成分，不僅對(duì)血管及血液中引起動(dòng)脈粥樣硬化、血稠和栓塞的物質(zhì)具有重要影響，而且還具有抗癌作用［13］。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法對(duì)該制劑中的上述7種親脂性成分進(jìn)行了定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，2996型二極管矩陣檢測(cè)器，Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；AB265-S型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；CHA121-50-01超臨界萃取裝置（南通華安超臨界萃取有限公司）；FW177中草藥粉碎機(jī) （天津泰斯特儀器有限公司）；GZX-9240型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 （上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥 對(duì)照品姜黃素 （批號(hào) 110823-201004），莪術(shù)二酮 （批號(hào)111800-201001），莪術(shù)醇 （批號(hào)100185-201007），牻牛兒酮 （吉馬酮）（批號(hào)111665-201204），呋喃二烯 （批號(hào)111824-201102），亞油酸 （批號(hào)111622-201203），β-欖香烯 （批號(hào)100268-201402），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。無水乙醇、磷酸 （分析純，天津富宇精細(xì)化工），乙腈（色譜純，美國(guó)Sigma-A1drich公司），屈臣氏蒸餾水。復(fù)方理沖生髓飲方中各藥由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)孫慧峰教授鑒定均符合 《中國(guó)藥典》2010年版各項(xiàng)下藥材規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 理沖生髓飲的制備 取處方量的藥材，適當(dāng)粉碎，以超臨界萃取 （SCFE）法萃取，獲得萃取物；藥渣繼續(xù)以75%乙醇回流提取，提取液回收乙醇后濃縮至適量；藥渣揮盡溶劑后，繼續(xù)以水回流提取，水提液濃縮后，與上述濃縮液合并，加入萃取物，攪勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 精密吸取理沖生髓飲適量，減壓旋干溶劑后，加無水乙醇超聲溶解，并定容至50 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取對(duì)照品姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯適量，精密稱定，加無水乙醇分別制成每1 mL含姜黃素407.0μg、莪術(shù)二酮672.0 μg、莪術(shù)醇248.8μg、牻牛兒酮455.2μg、呋喃二烯203.0μg、亞油酸529.5μg、β-欖香烯709.0 μg的溶液作為各對(duì)照品貯備液，再分別吸取各對(duì)照品貯備液5.0 mL置50 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度作為對(duì)照品混合溶液。

2.4 陰性對(duì)照液的制備 按 “2.1”項(xiàng)理沖生髓飲的制備方法分別制備缺莪術(shù)、缺黃芪、鹿茸的樣品；按 “2.2”項(xiàng)供試品溶液的制法制備陰性對(duì)照液。

2.5 色譜條件 色譜柱為Dikma Diamonsi1-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液 （A）-乙腈 （B）梯度洗脫 （0～15 min，45%→60%B；15～25 min，60%→70%B；25～35 min，70%B；35～50 min，70%→88%B；50～58 min，88%→90%B；58～68 min，90%→95%B；68～75 min，95%→100%B）。柱溫30℃，體積流量1 m L/min，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系的考察 按逐級(jí)稀釋法，分別精密吸取上述對(duì)照品混合溶液0.1、0.5、1、3、5 mL于25 mL量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，得混合對(duì)照品系列溶液，按 “2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積 （Y）對(duì)質(zhì)量濃度 （X）進(jìn)行線性回歸，得到7種成分的回歸方程分別為Y= 7 977.5X+5 038，r=0.999 7；Y=1 310.8X+ 14 055，r=0.999 7；Y=3 714.4X+20 810，r= 0.999 5；Y=8 327.2X+9 517.5，r=0.999 6；Y=28 336X+22 994，r=0.999 8；Y=19 224X+ 27 857，r=0.998 5；Y=7 270.4X+2 423.5，r= 0.999 5。姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯分別在0.16～8.14 μg/mL、0.27～13.44μg/m L、0.10～4.98 μg/mL、0.18～9.10μg/mL、0.08～4.06μg/mL、0.21～10.59μg/mL、0.28～14.18μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 系統(tǒng)適應(yīng)性 取陰性對(duì)照液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按 “2.5”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，各對(duì)照品色譜峰與其左右干擾峰分離度在1.5～5.3之間，姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的保留時(shí)間分別為8.359、17.208、24.694、29.899、44.328、 51.314、58.622 min，理論塔板數(shù)均大于7 000，如圖1所示。

圖1 理沖生髓飲HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of Lichong Shengsui Drink

2.6.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)得姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的峰面積，其RSD分別為0.54%、0.48%、0.63%、0.77%、0.87%、0.95% 和0.69%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已配制好同一供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12、24 h注入色譜儀，計(jì)算各組分色譜峰的峰面積RSD，測(cè)得姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的RSD值分別為1.05%、0.99%、1.31%、1.18%、1.43%、1.42%和1.08%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取理沖生髓飲適量，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.5”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，結(jié)果姜黃素、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、呋喃二烯、亞油酸、β-欖香烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.83%、 1.91%、 1.69%、 1.77%、 1.95%、1.83%和1.76%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知各成分含有量的理沖生髓飲10 m L 9份，按其中所含各成分的80%、100%和120%質(zhì)量分別精密加入對(duì)照品混合溶液0.8、1.0、1.2 mL，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按 “2.5”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定。結(jié)果見表1～7。

表1 姜黃素加樣回收率Tab.1 Resu lts of recovery tests for curcum in

2.7 樣品測(cè)定 精密吸取3份不同批供試品溶液，按 “2.5”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，將峰面積帶入上述線性回歸方程計(jì)算，得各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見表8。

表2 莪術(shù)二酮加樣回收率Tab.2 Results of recovery tests for curdione

表3 莪術(shù)醇加樣回收率Tab.3 Results of recovery tests for curcumol

表4 牻牛兒酮加樣回收率Tab.4 Resu lts of recovery tests for germacrone

表5 呋喃二烯加樣回收率Tab.5 Results of recovery tests for furanodiene

表6 亞油酸加樣回收率Tab.6 Results of recovery tests for linoleic acid

表7 β-欖香烯加樣回收率Tab.7 Results of recovery tests forβ-elem ene

表8 理沖生髓飲中7種成分的測(cè)定結(jié)果Tab.8 Determ ination of seven constituents in Lichong Shengsui D rink

3 討論

中藥制劑質(zhì)量控制的模式正由單指標(biāo)向多指標(biāo)，由單成分向大類成分 （有效部位）質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)變。理沖生髓飲中的揮發(fā)油類、皂苷類、黃酮類、多糖類成分等均為其治療卵巢癌的物質(zhì)基礎(chǔ)［8-13］。我們?cè)噲D建立一種能夠同時(shí)測(cè)定這些類成分的高效液相分析方法，但由于這些成分理化性質(zhì)差異較大，供試品溶液的制備、流動(dòng)相的組成、檢測(cè)器的要求等很難統(tǒng)一，因此，只能分別建立定量測(cè)定方法。

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%醋酸水溶液系統(tǒng)梯度洗脫的分離效果進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水與乙腈-水系統(tǒng)嚴(yán)重拖尾，分離效果較差；而乙腈-0.1%甲酸水溶液與乙腈-0.1%醋酸水溶液紫外末端吸收較大，基線漂移，影響色譜圖檢識(shí)；乙腈-0.1%磷酸水溶液能夠?qū)⒏鹘M分分離，且峰形較好，基線平穩(wěn)，因而選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描，對(duì)203 nm、210 nm、216 nm和220 nm波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較，結(jié)果顯示，供試品在210 nm處能夠?qū)⒏鹘M分檢出，且各峰之間分離度較好，因此選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠，可同時(shí)測(cè)定理沖生髓飲中姜黃素、莪術(shù)醇、牻牛兒酮、莪術(shù)二酮、呋喃二烯、β-欖香烯及亞油酸等7種親脂性成分，從而為理沖生髓飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)，并為該方進(jìn)一步開展治療卵巢癌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

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Sim ultaneous determ ination of seven lipophilic constituents in Lichong Shengsui Drink by HPLC-DAD

WANG Yan-hong1， SHANG Dong-xue1， LI Yang1， ZHAO Yong-wei1， ZHANG Yan2，HAN Feng-juan2*
（1.Heilongjiang University ofChineseMedicine，Harbin 150040，China；2.FirstAffiliated Hosital，Heilongjiang University of ChineseMedicine，Harbin 150040，China）

AIMTo estab1ish an HPLC-DAD method for simu1taneous1y determining the contents of curcumin，curcumo1，cermacrone，curdione，furanodiene，β-e1emene and 1ino1eic acid in Lichong Shengsui Drink（LCSSD）.METHODSHPLC ana1ysis of LCSSD methano1ic extract was performed on Dikma Diamonsi1-C18（250 mm×4.6mm，5μm）co1umn with themobi1e phase of0.1%phosphoric acid aqueous so1ution as phase A and acetonitri1e as phase B in gradient e1ution manner.The vo1umetric f1ow rate was 1 mL/min and the detection wave1ength was set at210 nm.RESULTSEvery constituentwas separated perfect1y and good 1iner re1ationships between peak area and mass concentration were obtained in the ranges of 0.16-8.14μg/mL，0.27-13.44 μg/mL，0.10-4.98μg/mL，0.18-9.10μg/mL，0.08-4.06μg/mL，0.21-10.59μg/mL and 0.28-14.18μg/mL，respective1y.The average recovery ratewaswithin the ranges of96.76%-100.38%.CONCLUSIONThismethod is accurate and re1iab1e for the determination of above-mentioned seven 1ipophi1ic constituents in LCSSD.

Lichong Shengsui Drink（LCSSD）；curcumin；curcumo1；curdione；germacrone；furanodiene；β-e1emene；1ino1eic acid

R927.2

A

1001-1528（2015）08-1713-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.017

2014-10-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81273788）

王艷宏（1972—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥性味理論和中藥制劑現(xiàn)代化研究。E-mai1：wang.yanhong@163.com

*通信作者：韓鳳娟 （1971—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合診治婦科腫瘤研究。E-mai1：hanfengjuan2004@163.com