非布司他原料2種含量測(cè)定方法的比較研究

沈衛(wèi)陽(yáng)，郭靜沫，施 睿，沈圃毅，金祥飛（1.中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，南京 210009；2.藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；.南京師范大學(xué)附屬中學(xué)，南京 21000）

·藥物分析·

非布司他原料2種含量測(cè)定方法的比較研究

沈衛(wèi)陽(yáng)1，2＊，郭靜沫1，2，施 睿3，沈圃毅3，金祥飛1，2（1.中國(guó)藥科大學(xué)理學(xué)院，南京 210009；2.藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；3.南京師范大學(xué)附屬中學(xué)，南京 210003）

目的 建立并比較滴定法和高效液相色譜法測(cè)定原料中非布司他含量。方法 化學(xué)分析法，用乙醇作為溶劑，氫氧化鈉溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，酚酞為指示劑進(jìn)行滴定。高效液相色譜法，采用Inertsil ODS－SP（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為1 mL·L－1磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至2.4）－乙腈（45∶55）；流速為1.5mL·min－1；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為315nm。結(jié)果 2種方法均符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，測(cè)定同一樣品，測(cè)量值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 2種分析方法均能快速、有效地測(cè)定原料中非布司他的含量，均可作為非布司他原料質(zhì)量控制的分析方法。

非布司他；含量測(cè)定；容量分析；高效液相色譜法

非布司他是一種非嘌呤、非競(jìng)爭(zhēng)性的黃嘌呤氧化酶（XO）抑制劑［1］，用于治療痛風(fēng)，2009年2月獲美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)，同年3月在美國(guó)上市。該藥2010年獲歐盟批準(zhǔn)，先后在法國(guó)、英國(guó)和德國(guó)等多個(gè)國(guó)家上市［2］，在中國(guó)于2013年2月上市［3］。與別嘌醇和安慰劑相比，非布司他在降低患者血尿酸水平方面更有效。輕中度肝功能損害及輕中度腎功能損害對(duì)非布司他的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)顯著影響［4］。本文建立了酸堿滴定法和高效液相色譜法對(duì)非布司他原料的含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)2種方法進(jìn)行了比較［4－6］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－2010AHT高效液相色譜儀（包括LC－10AT泵、LC－20ADAD檢測(cè)器和LC solution色譜工作站，日本島津公司）；UV－1800紫外分光光度儀（日本島津）；BS124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 非布司他（批號(hào)20110612，20110616，20110620，由福州辰星藥業(yè)有限公司提供）；非布司他對(duì)照品（批號(hào)20110529，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，由福州辰星藥業(yè)有限公司提供）；乙腈（色譜純，Merck公司）；超純水（優(yōu)普超純水制造儀）；其余試劑除注明外均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 滴定法

2.1.1 滴定方法選擇 非布司他在乙醇中略溶，在水中幾乎不溶。從結(jié)構(gòu)式（見圖1）可以看出，非布司他中含有一個(gè)羧基官能團(tuán)，可與堿發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，故選擇乙醇作為溶劑，氫氧化鈉為滴定液進(jìn)行滴定。

取本品約0.65g，精密稱定，加中性乙醇50mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L－1）滴定。每1mL氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L－1）相當(dāng)于31.64mg的C16H16N2O3S。

2.1.2 滴定曲線的繪制與指示劑的選擇 在滴定分析中，我們用電位滴定法進(jìn)行了滴定終點(diǎn)的判斷，并考察了酚酞作為指示劑，化學(xué)計(jì)量點(diǎn)前后溶液顏色的變化情況。滴定曲線如圖2所示。

圖1 非布司他的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of febuxostat

圖2 滴定曲線Fig.2 Titration curve

由圖2可知，該法滴定突躍大，終點(diǎn)顏色變化明顯（從無(wú)色→淡紅色），指示劑法判斷滴定終點(diǎn)與電位滴定二階微商線性內(nèi)插法結(jié)果相一致。

2.1.3 成比例的系統(tǒng)誤差、額外的系統(tǒng)誤差與精密度實(shí)驗(yàn) 稱取7份不同質(zhì)量的非布司他供試品（0.163 4，0.337 9，0.415 3，0.495 9，0.571 2，0.653 5和0.730 8g），加中性乙醇50mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氫氧化鈉滴定液（0.1mol·L－1）滴定，使滴定終點(diǎn)消耗的滴定液體積為所用滴定管體積（25mL）的20%，40%，50%，60%，70%，80%和90%，記錄供試品的滴定體積。以滴定體積為因變量對(duì)供試品質(zhì)量進(jìn)行回歸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 滴定的線性方程Tab.1 Linear equation of titration

2.1.3.1 成比例的系統(tǒng)誤差 按公式（1）和（2）進(jìn)行計(jì)算。

bobs為表1中線性方程計(jì)算得到的斜率；btheor為滴定常數(shù)；Mr為相對(duì)分子質(zhì)量；Z為化學(xué)反應(yīng)的計(jì)量系數(shù)；Cr為滴定液的濃度，本實(shí)驗(yàn)Cr＝0.099 06 mol·L－1。

結(jié)果表明，成比例的系統(tǒng)誤差為－0.06%，滿足定量分析法中含量測(cè)定對(duì)成比例系統(tǒng)誤差的絕對(duì)值小于0.5%的要求。

2.1.3.2 額外的系統(tǒng)誤差 按公式（3）和（4）進(jìn)行計(jì)算。

aobs為線性方程的截距；mT為供試品的預(yù)期稱樣量，本實(shí)驗(yàn)mT＝0.65g；VT為預(yù)期或目標(biāo)滴定體積。

結(jié)果表明，額外的系統(tǒng)誤差為－0.32%，滿足絕對(duì)值小于0.6%的要求。

2.1.3.3 精密度（統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差） 按公式（5）和（6）進(jìn)行計(jì)算。

sdv（V）是標(biāo)準(zhǔn)偏差的估計(jì)值；Vi為消耗滴定液的體積；mi為供試品的實(shí)際稱樣量；n為滴定的次數(shù)。

結(jié)果表明，該方法的精密度為0.24%，滿足小于0.5%的要求。

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取本品（批號(hào)20110612）6份，按2.1.1項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，測(cè)定其含量，結(jié)果含量平均值為99.58%，RSD為0.12%，Δx值為－0.42%，符合含量限度99%～101%、重復(fù)性RSD＜0.33%、相對(duì)準(zhǔn)確度±0.67%的要求［7］，因此，用酸堿滴定法測(cè)定非布司他含量是可行的。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件 采用Inertsil ODS－SP（250mm ×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈－1mL·L－1磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至2.4）（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)為315nm；流速為1.5mL·min－1；進(jìn)樣體積20 μL；柱溫為30℃。

2.2.2 對(duì)照品溶液及供試品溶液的配制 精密稱取非布司他自制對(duì)照品約3mg，置于10mL量瓶中，加乙腈溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。精密稱取非布司他供試品約15mg，置于50mL量瓶中，加乙腈溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 線性范圍考察 精密稱取非布司他自制對(duì)照品14.90mg，置于50mL量瓶中，用乙腈溶解并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為300 μg·mL－1的非布司他標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10，0.20，0.50，1.00，2.00和5.00mL，置于10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為2.98，5.96，14.90，29.80，59.60和149.00μg·mL－1的非布司他標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。精密量取各標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20μL，注入高效液相色譜儀，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、非布司他質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y＝65 016 X－2 176，r＝0.999 9。結(jié)果表明，非布司他質(zhì)量濃度在2.98～149.00μg·mL－1范圍內(nèi)，與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中14.90 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD為0.032%；取同一批原料（批號(hào)20110612），由不同分析人員在不同日期，在2臺(tái)高效液相色譜儀上進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果平均含量為99.50%，RSD為0.50%（n＝8），可見該方法進(jìn)樣精密度和中間精密度均良好。

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)原料（批號(hào)20110612），平行測(cè)定6次，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為99.67%，RSD為0.52%（n＝6），表明重復(fù)性良好。

2.2.6 檢測(cè)限與定量限 取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中2.98 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，用稀釋法測(cè)其檢測(cè)限（S／N＝3）和定量限（S／N＝10），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本色譜系統(tǒng)條件下，檢測(cè)限約為0.07ng，定量限約為0.2ng。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取1份非布司他含量測(cè)定供試品溶液（批號(hào)20110612）于0，2，4，8和24h分別進(jìn)樣，測(cè)得峰面積RSD為0.053%（n＝6），可見其在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好，能夠滿足測(cè)定要求。

2.2.8 方法專屬性 非布司他原料（批號(hào)20110612）經(jīng)酸、堿、高溫、氧化和光照破壞后，配制成供試品溶液，各取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分保留時(shí)間的3倍。結(jié)果降解產(chǎn)生的雜質(zhì)均能與非布司他完全分離，分離度（R）均＞1.5；主峰峰純度均為1.000，表明非布司他主峰中不包含其他雜質(zhì)峰。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法專屬性強(qiáng)，可用于原料中非布司他的含量測(cè)定。色譜圖見圖3。

圖3 高效液相色譜圖A.未破壞樣品；B.酸破壞樣品；C.堿破壞樣品；D.氧化破壞樣品；E.高溫破壞樣品；F.強(qiáng)光破壞樣品Fig.3 HPLC chromatogramsA.non－destruction sample；B.acid destruction sample；C.alkali destruction sample；D.oxidative destruction sample；E.high temperature destruction sample；F.light destruction sample

3 滴定法與高效液相色譜法的比較

取非布司他原料藥（批號(hào)20110612）用滴定法和高效液相色譜法分別平行測(cè)定6次，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 2種含量測(cè)定方法結(jié)果比較Tab.2 The results determined by the two methods （n＝6）

由此認(rèn)為，這2種方法精密度不存在顯著差異（P＜0.05）。

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 非布司他紫外吸收譜在217和315nm處有吸收峰，考慮217nm處接近末端吸收，干擾較大，基線噪聲大，不易平衡，且315nm處吸收大，干擾小，故高效液相色譜法選擇315nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了磷酸體系、甲酸體系和乙酸體系，結(jié)果磷酸體系基線穩(wěn)定，與最近雜質(zhì)分離度較好。非布司他結(jié)構(gòu)中含有羧基官能團(tuán)，應(yīng)將流動(dòng)相調(diào)節(jié)為酸性，使其呈游離狀態(tài)，考察結(jié)果表明，pH從4.0降到2.4，峰形有明顯改善，pH繼續(xù)從2.4降低到2.0，峰形幾乎沒(méi)有變化，pH過(guò)低對(duì)色譜柱傷害較大，所以最終選定pH為2.4。

4.3 含量測(cè)定方法的選擇 原料藥的純度要求高，限度要求嚴(yán)格，含量測(cè)定注重方法的準(zhǔn)確性。酸堿滴定法為容量分析法，操作較簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度較高，可以不用對(duì)照品，并且避免了使用貴重儀器［8］，在有關(guān)物質(zhì)檢查同時(shí)控制的條件下，可以首先考慮用滴定法；高效液相色譜法是進(jìn)行新藥包括原料藥研發(fā)與質(zhì)量控制的理想方法，分離效率高，精確度高，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化，應(yīng)用廣泛［9－11］。此2種方法均能準(zhǔn)確有效地檢測(cè)原料中非布司他的含量，可以根據(jù)分析目的和實(shí)驗(yàn)室條件，選擇適宜的方法。

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Comparitive study on two assay methods of febuxostat

SHEN Weiyang1，2＊，GUO Jingmo1，2，SHI Rui3，SHEN Fuyi3，JIN Xiangfei1，2（1.School of Sciences of China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance Ministry of Education，Nanjing 210009，China；3.the Affiliated Senior High School of Nanjing Normal University，Nanjing 210003，China）

Objective To establish and compare the titration method and high performance liquid chromatography（HPLC）method for determining the content of febuxostat.Methods For chemical analysis，ethanol was used as the solvent，sodium hydroxide as the volumetric solution and phenolphthalein as an indicator for titration.The HPLC was carried out on an Inertsil ODS－SP（250 mm×4.6mm，5μm）column；the mobile phase consisted of 1mL·L－1phosphoric acid solution（adjust pH value to 2.4by triethylamine）－acetonitrile（45∶55）with a flow rate of 1.5mL·min－1；the column temperature was set at 30℃；the detection wavelength was 315nm.Results The 2methods both met the requirements of methodology validation，and there was no significant difference between the results obtained from the titration method and HPLC method（P＜0.05）.Conclusion The two methods can detect febuxostat content effectively and suitable for the quality control of febuxostat.

febuxostat；content determination；volumetric titrations；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.009

R927.2

A

1004－2407（2015）02－0134－04

2014－09－10）

＊通信作者：沈衛(wèi)陽(yáng)，男，博士，副教授

郭靜沫，女，在讀碩士研究生