牡荊素人工抗原的合成與免疫原性的鑒定

馮盛嵐， 屈會化， 賀娜娜， 趙靈靈， 任雅君， 成金俊， 趙 琰， 王慶國

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102；2.北京中醫(yī)藥大學 “經(jīng)典方劑的應用基礎研究”創(chuàng)新團隊，北京100029；3.北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心，北京100029；4.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京100029）

牡荊素人工抗原的合成與免疫原性的鑒定

馮盛嵐1，2， 屈會化2，3#， 賀娜娜1，2， 趙靈靈1，2， 任雅君1，2， 成金俊1，2， 趙 琰2，4*， 王慶國2，4*

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京100102；2.北京中醫(yī)藥大學 “經(jīng)典方劑的應用基礎研究”創(chuàng)新團隊，北京100029；3.北京中醫(yī)藥大學科研實驗中心，北京100029；4.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京100029）

目的合成牡荊素的人工抗原，并對其免疫原性進行了鑒定。方法利用高碘酸鈉氧化法偶聯(lián)牡荊素制備牡荊素-牛血清白蛋白的免疫抗原和牡荊素-卵清蛋白的包被原；用紫外分光光度法和薄層色譜法鑒定小分子與載體蛋白偶聯(lián)反應，并用間接ELISA測定免疫抗原免疫小鼠抗體效價，間接競爭ELISA（ic-ELISA）檢測抗體特異性。結果紫外掃描和薄層色譜結果表明牡荊素與牛血清白蛋白/卵清蛋白偶聯(lián)成功，小鼠經(jīng)牡荊素-牛血清白蛋白免疫后，體內產(chǎn)生了抗牡荊素抗體，效價在1：16 000以上，線性檢測范圍為0.028 8～18μg/mL。結論合成的牡荊素人工抗原和專屬酶聯(lián)免疫分析法可用于后續(xù)的單克隆抗體的制備。

牡荊素；牛血清白蛋白；卵清蛋白；抗牡荊素抗體；高碘酸鈉法；免疫分析法

牡荊素（vitexin，VXn）是山楂葉、淡竹葉等植物的主要活性成分之一［1-2］，屬于黃酮碳苷類天然產(chǎn)物，還以其他苷類形式廣泛存在于許多中草藥中，并成為其有效成分。牡荊素具有降壓、降脂、抗氧化、抗腫瘤、抗感染、保護心血管、舒張氣管平滑肌等多種藥理活性［3-9］，是益心酮片、復方丹參降脂顆粒、咳特靈膠囊等中成藥的有效成分［10-12］，有較高的藥用價值及經(jīng)濟價值。

目前，牡荊素的定性檢測與定量測定的分析方法有高效液相色譜法 （HPLC）、液質聯(lián)用法（HPLC-MS）、毛細管電泳法等［10，13-14］，其中以HPLC法最為常用。但中藥活性成分眾多，而且含牡荊素的某些生物樣品含有大量的影響成分定量測定的蛋白質及內源性物質，處理程序繁復，操作耗時費力。近年來，小分子單克隆抗體技術發(fā)展迅速，以該技術為依托的中藥活性成分免疫分析方法具有高靈敏度、高通量、強特異性、前處理簡單以及不依賴貴重儀器等特點，在中藥成分分析中具有獨特的優(yōu)勢，引起了國內外廣泛關注［15-16］。為了建立牡荊素免疫分析方法，本研究首先合成了牡荊素的人工抗原，并對其免疫原性進行了鑒定。

1 材料及儀器

1.1 動物 SPF級Balb/c小鼠4只，6～8周齡，雌性，維通利華實驗動物中心提供，許可證號SCXK（京）2012-0001。

1.2 試劑 牡荊素，成都普菲德生物技術有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA），北京欣經(jīng)科生物技術有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），美國 Sigma公司；高碘酸鈉（NaIO4），分析純，國藥集團北京化學試劑公司；弗氏完全佐劑 （F5881），美國Sigma公司；弗氏不完全佐劑 （F5506），美國Sigma公司；酶標二抗（HRP-標記羊抗鼠IgG），美國Gene-Script公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB），美國Sigma公司；碳酸鹽緩沖液（CBS，pH 9.6，0.05 mmol/L，自制）；磷酸鹽緩沖液 （PBS，pH 7.4，自制）；洗滌緩沖液（PBST，pH 7.4，自制）；底物緩沖液 （磷酸檸檬酸，pH 5.0，自制）；終止液（2 mmol/L H2SO4，自制）。

1.3 儀器 BS124S電子分析天平 （德國賽多利斯公司）；84-1A磁力攪拌器 （上海司樂儀器有限公司）；可調微量加樣器 （德國Eppendorf公司）；14000截留透析袋 （美國Sigma公司）；Beckman coulter DU 800紫外-可見分光光度計（美國Beckman公司）；TGL-16G臺式高速冷凍離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；96孔酶標板 （美國Corning公司）；Tecan Safire 2全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；Millipore純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 牡荊素人工抗原的合成 以本實驗室以往經(jīng)驗為參考［17-19］，采用高碘酸鈉法，將牡荊素與卵清蛋白偶聯(lián)成包被原，與牛血清白蛋白偶聯(lián)成人工免疫原。具體方法如下：準確稱量4.8 mg牡荊素置于棕色西林瓶中，用4 mL DMF使其完全溶解。NaIO45.0 mg充分溶于1 mL蒸餾水中，將后者逐滴加入前者中，加好后密封，錫箔紙包裹避光，室溫下磁力攪拌反應1.5 h，得牡荊素氧化產(chǎn)物，稱為A液。準確稱量牛血清白蛋白/卵清蛋白各3.6 mg，分別充分溶于2 m L CBS中，稱為B液。然后將A液逐滴加入B液中，滴加完畢后，用1 mol/L Na2CO3調pH至9.0以上，在封閉的條件下室溫下攪拌過夜。待上述反應完成后，將其轉移至透析袋中，透析袋先用蒸餾水預處理，混合液在攪拌條件下用蒸餾水透析72 h，中間多次換液至透析袋外部液體中無法測出牡荊素。透析后的產(chǎn)物分裝，于-20℃保存待用。

2.2 牡荊素人工抗原的鑒定

2.2.1 紫外分光光度法 用蒸餾水配制合適濃度的牛血清白蛋白、卵清蛋白與牡荊素標準溶液，將待測樣品用蒸餾水稀釋到合適濃度，使它們在紫外分光光度計全波長掃描中能呈現(xiàn)完整的圖像［20］，測出牡荊素-牛血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、牡荊素-牛血清白蛋白、牡荊素-卵清蛋白的紫外全波長圖譜。

2.2.2 薄層色譜法 將已透析過的待測樣品牡荊素-牛血清白蛋白和牡荊素-卵清蛋白用蒸餾水稀釋到合適濃度，用蒸餾水配制合適濃度的牡荊素、牛血清白蛋白、卵清蛋白標準溶液。將待測樣品和標準溶液分別點于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-甲醇 （4：1）為展開劑，3次展開后晾干，于254 nm紫外波長下觀察。

2.2.3 動物免疫 雌性Balb/c小鼠編號1～4號，用牡荊素-牛血清白蛋白免疫1～3號小鼠，免疫方式為背部皮下多點注射免疫，剩余的4號小鼠作為陰性對照。首次免疫用等體積的弗式完全佐劑充分乳化，劑量以免疫原計約為60μg/只，以后隔1周左右加強免疫1次，加強免疫改用弗式不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量不作改變。第3次加強免疫開始后7 d斷尾取血。血液樣品4℃下5 000 r/min離心10 min，取血清，分別編號為1#、2#、3#、4#。

2.2.4 ELISA法測定血清中的抗體效價 以牡荊素-卵清蛋白為包被原，用CBS稀釋1 000倍，100 μL/孔加入96孔酶標板中，37℃孵育1 h。PBST洗板3次，每次5 min，拍干。用10 mg/mL明膠封閉，每孔200μL，37℃孵育1 h。洗板，操作同上。將1～3號小鼠的抗血清稀釋1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000倍，分別將稀釋好的血清以100μL/孔的量加入孔中。以4號小鼠的血清作為陰性對照，37℃孵育1 h，洗板。PBS稀釋HRP-羊抗鼠二抗10 000倍，每孔加入100μL，37℃孵育0.5 h，洗板5次，拍干。每孔加入顯色液100μL，37℃孵育顯色，15 min后每孔50μL終止液終止反應，終止液為2 mmol/L硫酸，測定OD450nm吸光度。以同一稀釋倍數(shù)下抗血清 （P）與陰性血清 （N）OD450nm比值（P/N）大于2.1時血清的最大稀釋度定為抗體效價。

2.2.5 ic-ELISA法測定血清中的抗體特異性 以牡荊素-卵清蛋白作為包被原，用CBS稀釋1 000倍，100μL/孔加入96孔酶標板中，37℃孵育1 h。以PBST洗板3次，每次5 min，拍干。用10 mg/mL明膠封閉，每孔加200μL，37℃孵育1 h。洗板，操作同上?？寡逑♂尡稊?shù)為1 000，牡荊素分 別 稀 釋 為 90、18、3.6、0.72、0.144、0.028 8μg/mL和對照值0μg/mL，每孔先加入小分子50μL，再加入抗血清50μL。37℃孵育1 h，洗板3次。每孔加入100μL HRP-羊抗鼠二抗，二抗用PBS稀釋10 000倍，37℃孵育0.5 h，洗板5次。每孔加入顯色液100μL，37℃孵育顯色15 min后每孔加2 mmol/L硫酸50μL終止反應，測定OD450nm吸光度。

3 結果

3.1 牡荊素-牛血清白蛋白，牡荊素-卵清蛋白的紫外分光光度鑒定 牡荊素、牛血清白蛋白、牡荊素-牛血清白蛋白的紫外分光光度結果如圖1所示。牡荊素在268 nm處有吸收峰，牛血清白蛋白紫外特征吸收峰為278 nm，而牡荊素-牛血清白蛋白在190 nm到300 nm的紫外吸收與牡荊素、牛血清白蛋白在此段波長的紫外吸收不相同，展示出了與牡荊素、牛血清白蛋白不同的特性，說明有新的物質生成。牡荊素-卵清蛋白的紫外圖譜同樣顯示出了與牡荊素和牛血清白蛋白不同的特性 （見圖2），因此可以判斷牡荊素與牛血清白蛋白、卵清蛋白偶聯(lián)成功。

圖1 牡荊素-牛血清白蛋白紫外掃描圖Fig.1 Full-w ave ultraviolet spectrogram of vitexin-BSA

圖2 牡荊素-卵清蛋白紫外掃描圖Fig.2 Full-wave ultraviolet spectrogram of vitexin-OVA

3.2 牡荊素-牛血清白蛋白，牡荊素-卵清蛋白的薄層色譜圖 薄層色譜是鑒定人工抗原是否合成成功的簡便方法［21］。牡荊素、牛血清白蛋白、牡荊素-牛血清白蛋白薄層結果如圖3，牡荊素、卵清蛋白、牡荊素-卵清蛋白薄層結果如圖4，牡荊素-牛血清白蛋白在展開劑條件下能夠展開并在254 nm紫外燈下呈黑色斑點，牛血清白蛋白、卵清蛋白是蛋白質大分子，在此條件下不會展開，也不會顯色，而牡荊素-牛血清白蛋白，牡荊素-卵清蛋白未展開，但二者卻在點樣原點顯示黑色斑點，說明了二者同時具有載體蛋白與牡荊素的特點，上述結果說明牡荊素與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯(lián)成功。

3.3 ELISA法測定血清中的抗體效價結果 經(jīng)過5次免疫后，小鼠產(chǎn)生抗牡荊素抗體，以P/N值≥2.1時的稀釋倍數(shù)為血清的效價，則小鼠血清效價均在1：16 000以上。結果如圖5所示。

圖3 牡荊素，牡荊素-牛血清白蛋白，牛血清白蛋白薄層Fig.3 TLC ch romatogram of vitexin，vitexin-BSA and BSA

圖4 牡荊素，牡荊素-卵清蛋白，卵清蛋白薄層Fig.4 TLC chromatogram of vitexin，vitexin-OVA and OVA

圖5 ELISA法測定抗牡荊素抗體的效價Fig.5 Serum tilter of vitexin-BSA immunised m ice 1-3

3.4 ic-ELISA法測定血清中的抗牡荊素抗體特異性 檢測結果表明，牡荊素對3只小鼠的免疫血清均有競爭抑制，這說明小鼠血清中產(chǎn)生的抗體對牡荊素具有特異性。以牡荊素質量濃度為0對應的孔OD450值為A0，以其他各種質量濃度牡荊素對應的孔OD450值為A，計算出小鼠抗血清間接接競爭抑制曲線的線性方程和r2，結果見表1。其中競爭最好的是3號小鼠，其抗血清的競爭抑制曲線斜率是-0.084，相關系數(shù)可達0.998 1。

表1 牡荊素-牛血清白蛋白免疫小鼠抗血清的間接競爭試驗結果Tab.1 Linear equation of ic-ELISA

4 討論

基于中藥小分子抗體的免疫分析方法不受中藥活性成分眾多、樣品前處理復雜等問題的困擾，它不僅具有耗時少、高通量、高靈敏度、高準確度、受內源性物質影響小等優(yōu)點，而且有酶聯(lián)免疫分析法、熒光免疫分析法、免疫芯片法等多種技術形式，因此，它在中醫(yī)藥領域具有廣闊的應用前景［17，22］。合成牡荊素人工抗原，產(chǎn)生抗牡荊素抗體，進而建立相應的免疫分析方法，我們可將其應用于含牡荊素的中藥飲片和中成藥等的分析檢測和質量控制，以及進行相關藥物作用機理和藥代動力學的深入研究。

牡荊素人工抗原的合成參考了本實驗室以往經(jīng)驗［19，23-24］，采用高碘酸鈉氧化法。高碘酸鈉法操作簡便，合成條件溫和，其原理為高碘酸鈉氧將糖基側鏈中的鄰羥基氧化為雙醛基，雙醛基再與載體蛋白的氨基相偶聯(lián)形成人工抗原及包被原。高碘酸鈉能保留牡荊素的特征性結構，為下一步制備特異性高的牡荊素單克隆抗體奠定基礎。人工抗原合成除了適用于糖基的高碘酸鈉氧化法外，還有適用于羧基的混合酸酐法和碳二亞胺法等。選擇半抗原的連接基團不同，偶聯(lián)方法的選用、半抗原表位構型的表達也隨之產(chǎn)生差異。這種差異不僅影響半抗原的免疫原性，更決定了其免疫抗體的特異性［25］，故應慎重選擇。

目前，鑒別人工抗原合成成功與否的方法有多種，如質譜法、電泳法、同位素示蹤法、紫外分光光度法等［26］。本研究采用較為便捷的薄層色譜法和紫外光譜法對合成產(chǎn)物進行初步鑒定。薄層色譜法簡便易行，所需樣品量小，適用范圍廣而成本低，可以極大地推動人工抗原合成條件優(yōu)化的進程［27］。紫外分光光度法是一種成熟并易于普及的方法，操作簡單易于掌握，結果直觀便于分析，適用于人工抗原的初步鑒定。初步鑒定后，再通過間接ELISA和間接競爭ELISA對其免疫原性進行鑒定。經(jīng)過鑒定，牡荊素與載體蛋白 （牛血清白蛋白/卵清蛋白）成功偶聯(lián)，所合成的牡荊素-牛血清白蛋白可以使小鼠體內產(chǎn)生抗牡荊素抗體，效價在1：16 000以上；且產(chǎn)生抗體具有牡荊素特異性。這些結果也進一步證明了牡荊素人工抗原合成成功。

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Synthesis and identification of artificial antigens of vitexin

FENG Sheng-lan1，2， QU Hui-hua2，3#， HE Na-na1，2， ZHAO Ling-ling1，2， REN Ya-jun1，2， CHENG Jin-jun1，2， ZHAO Yan2，4*， WANG Qing-guo2，4*

（1.School of TCM，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2.Innovation Team of“Classical Prescriptions of Applied Basic Research”，Beijing 100029，China；3.Scientific Research and Experiment Center of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；4. School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

AIMTo synthesize the artificial antigen ofvitexin and identify its immunogenicity.METHODSCarrier protein was employed to couple vitexin to form immunogenic antigen（vitexin-BSA）and coating antigen（vitexin-ovalbumin）via sodium iodide oxidation method.UV spectrometry and thin layer chromatography（TLC）method was used in the characterization of the synthesis.Balb/c mice were immunized with the prepared vitexin-BSA immunogenic antigen.Their tilter and specificity of the anti-serum was examined and detected by indirect ELISA and indirect competitive ELISA（ic-ELISA），respectively.RESULTSUV spectrometry and TLC conformed that vitexin conjugated with ovalbumin and BSA were carried out.Receiving vitexin-BSA，the mice produced anti-vitexin antibodies specifically，whose titer was above 1：16 000，and their linear range detection was from 0.028 8μg/mL to 18μg/mL.CONCLUSIONThe synthesized artificial antigen of vitexin and special ELISA can be applied to the preparation ofmonoclonal antibodies.

vitexin；bovine serum albumin（BSA）；ovalbumin；anti-vitexin antibodies；sodium periodate oxidation；immunoassaymethod

R284.3

A

1001-1528（2015）04-0805-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.024

2014-10-08

國家自然科學基金 （81373542，81274043）

馮盛嵐 （1991—），女，碩士，研究方向為中藥免疫分析技術。

#共同第一作者：屈會化 （1966—），男，博士，副研究員，碩士生導師，研究方向為中藥免疫分析技術。Tel：（010）64286705，E-mail：quhuihua@gmail.com

*通信作者：趙 琰 （1973—），女，博士，研究員，博士生導師，研究方向為經(jīng)典方劑的現(xiàn)代應用。Tel：（010）64286705，E-mail：zhaoyandr@gmail.com