阻斷Hedgehog信號通路對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響

沈璇 黃繼錦 張雪 范芳 李長福

（遵義醫(yī)學(xué)院生化教研室，貴州 遵義563099）

Hedgehog是編碼一系列分泌蛋白的基因家 族，最早是在果蠅胚胎體中被發(fā)現(xiàn)［1］。Hedgehog信號通路是一種非常保守的經(jīng)典的信號通路，在胚胎的細(xì)胞生長和分化過程中起重要的作用［2］。細(xì)胞的生長與增殖受Hedgehog信號通路控制，而細(xì)胞生長增殖的失控則是腫瘤發(fā)生的一個過程。在人類細(xì)胞中，Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Hedgehog配體、Patched蛋白受體、Smothened跨膜受體、轉(zhuǎn)錄因子Gli等關(guān)鍵成分構(gòu)成［3］。目前大量的研究表明，Hedgehog信號通路的異常激活與腫瘤發(fā)生有關(guān)，抑制該通路的藥物已用于治療肺癌等腫瘤，Hedgehog信號通路對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制已成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路可能通過激活肝癌細(xì)胞中下游靶基因異常表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、自噬、抗輻射等肝癌形成及發(fā)展過程［4］。近來，Arzumanyan等［5］發(fā)現(xiàn)HBx蛋白可反式激活肝癌細(xì)胞的Shh信號通路，其表達(dá)水平與Gli2密切相關(guān)。Kim等［6］發(fā)現(xiàn)HB x蛋白能通過相互結(jié)合的方式增強Gli1的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，并與Gli1的核定位有關(guān)。Hedgehog信號通路與HBV密切相關(guān)，但對于它們是否協(xié)同調(diào)節(jié)HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移等過程，目前仍未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.2.15細(xì)胞株（中國典型培養(yǎng)物保藏中心），DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），PCR引物由上海生工合成。實時熒光定量PCR試劑盒（TakaRa公司），EDU檢測試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 細(xì)胞以1×105個／mL濃度種于96孔板中，培養(yǎng)24h，同步化24h，邊緣用滅菌PBS填滿。分別用含5μmol／L、15μmol／L、25μmol／L濃度環(huán)耙明的完全培養(yǎng)液作用，孵育24h、48h及72h后加入20μL 濃度5mg／mL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，加入150μL DMSO，置搖床上低速震蕩10min，待結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀OD490nm處檢測各孔的吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO）、對照孔（脂質(zhì)體處理組、質(zhì)?？蛰d體處理組），每組做3個平行。

1.2.2 EDU法檢測細(xì)胞DNA合成情況 實驗分組同上，用5μmol／L、15μmol／L、25μmol／L濃度環(huán)耙明處理24h、48h及72h后，加入含有EDU試劑的培養(yǎng)基孵育2h。去培養(yǎng)基，加入細(xì)胞固定液（4%多聚甲醛）室溫脫色搖床孵育30min后用PBS溶液漂洗3次，滴加0.5%Triton X-100浸泡細(xì)胞，染色反應(yīng)液500μL，常溫避光條件下孵育30min，加Hoechst染料后再孵育30min，PBS沖洗3次，風(fēng)干后封片。倒置熒光顯微鏡下拍照后統(tǒng)計DAPI標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)和EDU標(biāo)記有DNA合成的細(xì)胞數(shù)，DNA合成率 ＝EDU標(biāo)記有DNA合成的細(xì)胞數(shù)／DAPI標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 Real-time PCR法檢測細(xì)胞 Gli1mRNA 表達(dá)情況 實驗分組同上，細(xì)胞處理48h后，收集各孔細(xì)胞，用Trizol法提取RNA，在37℃15min，85℃5s條件下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再將cDNA進(jìn)行 Real-time PCR，引物如下。Gli1上游引物：5′-CA-GCTAGAGTCCAGAGGTTCAAGAG-3′，下游引物：5′-GTGAGTAGA-CAGAGGTTGGGAGGT-3′，擴增片段長度為108bp。β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-ACGAAGATCCGCCTG - ATACTGAATC-3′，擴增片段長度為232bp。經(jīng)Real-timePCR反應(yīng)儀器檢測，在擴增效率相同的基礎(chǔ)上，通過公式2－（△△CT）計算得到目的基因相對表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 以上實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，資料經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗后，行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗法。P＜0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)24h，用倒置顯微鏡觀察并拍照。低倍鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，且成片地“抱團”生長，形態(tài)通透、舒展呈多邊形或梭形（圖1A）；高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)有許多空泡狀病毒顆粒（圖1B）。

圖1 A 低倍鏡下（40×）Hep G2.2.15細(xì)胞

圖1 B 高倍鏡（100×）Hep G2.2.15細(xì)胞

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果（表1，圖2）顯示：5μmol／L濃度組各個時間段與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；15μmol／L濃度組在48h后與空白對照組存在差異（P＜0.05），48h、72h的生長抑制率分別為79.62%、75.10%；25μmol／L 濃度組的細(xì)胞生長抑制率在24h、48h及72h分別為68.9%、31.76%、23.66%，與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在各個時間段內(nèi)，環(huán)耙明濃度越高，HepG2.2.15細(xì)胞活率越低。

表1 不同濃度環(huán)耙明處理后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖情況（±s，n＝3）

表1 不同濃度環(huán)耙明處理后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖情況（±s，n＝3）

注：＊P＜0.05

組別24h 48h 72h空白照1.241±0.028 1.757±0.1295 1.695±0.100 5μmol／L 1.290±0.058 1.494±0.1366 1.580±0.057 15μmol／L 1.205±0.065 1.399±0.075＊ 1.273±0.06＊25μmol／L 0.845±0.139 0.5583±0.028＊ 0.401±0.079＊

圖2 不同濃度環(huán)耙明處理后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖情

2.3 EDU法檢測細(xì)胞DNA合成情況

結(jié)果（圖3）顯示，DNA合成百分比5μmol／L濃度組在72h后與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；15μmol／L濃度組在48h及72h與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；25μmol／L濃度組在24h、48h及72h時間點上均低于空白組 （P＜0.05）。由實驗結(jié)果可知，環(huán)耙明能在較高濃度時抑制細(xì)胞的DNA合成。

圖3 各組HepG2.2.15細(xì)胞的DNA合成

2.4 Real-timePCR檢測Gli1mRNA表達(dá)情況

Real-timePCR結(jié)果（表2，圖4）顯示：隨著環(huán)耙明濃度的增加，Gli1mRNA的表達(dá)逐漸降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各組間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明環(huán)耙明在HepG2.2.15細(xì)胞中具有劑量效應(yīng)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Gli1mRNA表達(dá)水平的Pearson相關(guān)系數(shù)為98.8，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組HepG2.2.15細(xì)胞的Gli1 mRNA表達(dá)（±s，n＝3）

表2 各組HepG2.2.15細(xì)胞的Gli1 mRNA表達(dá)（±s，n＝3）

注：＊P＜0.05

分組 β-actin（Ct value）Gli1（Ct value）Fold Change（2－△△Ct）空白組17.95±0.047 34.502±0.211 1.000±0.000 5μmol／L 17.224±.143 34.792±0..078 0.496±0.028＊15μmol／L 17.365±0.087 35.287±0.106 0.388±0.022＊25μmol／L 17.323±0.079 35.918±0.102 0.243±0.018＊

圖4 不同濃度環(huán)耙明處理組細(xì)胞Gli1mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

原發(fā)性肝癌在惡性腫瘤中發(fā)病率位居全球第三位，死亡率居第二位，嚴(yán)重威脅人類的身體健康［7］。目前，對肝癌治療的手段中，針對肝癌發(fā)病機制中關(guān)鍵分子進(jìn)行分子藥物靶向干預(yù)的生物治療展現(xiàn)了良好的前景。

Hedgeheg信號通路與腫瘤的分化及抗凋亡、遷移等發(fā)病機制有著密切的關(guān)系。在臨床治療中，使用Hedgehog信號通路抑制劑作為藥物治療已經(jīng)成為一種重要的輔助手段［8］。在體外實驗研究中，沉默Hedgehog的方法很多，其中使用環(huán)耙明阻斷Hedgehog信號通路已被廣泛應(yīng)用［9－12］。因此，本實驗在表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞中用一定濃度環(huán)耙明阻斷Hedgehog信號通路；用MTT及EDU檢測肝癌細(xì)胞的增殖能力。MTT實驗結(jié)果顯示，隨著環(huán)耙明濃度的提高，HepG2.2.15細(xì)胞活性逐漸降低，其中25μmol／L濃度環(huán)耙明處理組與空白組各時段差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。EDU實驗結(jié)果顯示25μmol／L濃度環(huán)耙明處理組的DNA合成率在各個檢測時間點上均低于對照組。MTT的結(jié)果與EDU法得出環(huán)耙明對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響基本一致，提示Hedgehog信號通路參與了對 HepG2.2.15細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)過程。在HepG2.2.15細(xì)胞中，抑制 Hedgehog信號通路的活性能降低細(xì)胞的增殖能力，其機制可能與HepG2.2.15細(xì)胞中Gli1的表達(dá)水平下降有關(guān)。Hedgehog信號通路對肝癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了重要作用，其高活化程度與肝癌惡化及預(yù)后差有著緊密的聯(lián)系。肝癌發(fā)生機制十分復(fù)雜，找出Hedgehog信號通路活化的原因十分必要，對其作進(jìn)一步深入研究，將給肝癌的治療提供必要的理論依據(jù)。

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