菟絲子含藥血清對TNF-α誘導凋亡蛻膜細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

秦明春，賀 蘭，李 利，周英惠，林 忠，張 吉

（廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

蛻膜細胞的凋亡是母兒免疫耐受的重要機制。在妊娠早期，蛻膜退化主要是以凋亡的形式進行，如果在孕早期發(fā)生蛻膜的異常退化或凋亡，就會破壞蛻膜組織重建和滋養(yǎng)細胞侵入所達到的相對穩(wěn)定的狀態(tài)，從而影響妊娠的繼續(xù)。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的炎癥和免疫調節(jié)因子之一，在孕早期，適量的TNF-α對妊娠的維持具有重要作用，但過量的TNF-α則會導致細胞過度凋亡甚至死亡，影響妊娠的繼續(xù)［1］。Bcl-2與Bax均屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用，Bax與Bc1-2結合后可使Bc1-2失活，細胞凋亡增加。在外界因素的刺激下，細胞的生死最終取決于Bc1-2和Bax兩種調控因子的平衡。菟絲子作為傳統(tǒng)的“補腎安胎”圣藥，已被廣泛運用于各種妊娠病的保胎治療中。本研究觀察菟絲子含藥血清作用于TNF-α誘導異常凋亡蛻膜細胞Bal-2和Bax蛋白的表達情況，擬從母胎界面蛻膜細胞的凋亡角度探討菟絲子可能的安胎機理。

1 實驗材料

1.1 標本來源 試驗用標本于2013年11月13～23日取自廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院婦科門診手術室，為正常妊娠40 d健康孕婦人流組織，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，并征得患者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基（批號AQK29046，Hyclone公司）；胎牛血清（批號 20130105，Hyclone公司）；胰蛋白酶（批號：ZJ0541，美國Amresco公司）；膠原酶Ⅱ（批號：20130-15，美國 Gibco 公司）；TNF-α（批號：10154，Biosource公司，分裝）；兔抗人Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學檢測試劑盒（批號：50977904，購自北京中杉金橋生物技術有限公司）；一抗兔抗人Bcl-2、Bax、GAPDH多克隆抗體（1 mg/ml）購自美國CST公司；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（Gel Doc2000型）。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 藥物 菟絲子含藥血清制備在廣西中醫(yī)藥大學藥學院藥物制劑實驗室進行，制備方法如下：將20只Wistar大鼠隨機分為菟絲子組和空白組2組。制備菟絲子藥液質量分數(shù)為170 g/L，給藥劑量＝臨床常用量×動物等效面積系數(shù)×5，每100 g體質量Wistar大鼠灌胃2 ml藥液，空白組給予等量生理鹽水灌胃，每日給藥2次，連續(xù)1周。于最后一次給藥1h后，無菌操作下采腹主動脈血，于4℃靜置2 h后用低溫離心機3 500 r/min離心15 min；收集血清經(jīng)56℃恒溫滅活30 min；用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方 法

2.1 原代蛻膜細胞的培養(yǎng) 參考文獻［1-2］采用復合消化酶法對蛻膜細胞進行培養(yǎng)，將培養(yǎng)3代細胞在載玻片上爬片，采用鏈霉素-生物素-過氧化物酶法（SABC）法進行泌乳素（PRL）免疫組化染色。

2.2 人蛻膜細胞異常凋亡模型的建立及藥物干預 以TNF-α誘導蛻膜細胞異常凋亡模型［3］。選取對數(shù)增長期生長良好的同一批細胞9瓶，每3瓶為一組，分別標記為對照組、模型組（予 TNF-α）、治療組（予 TNF-α＋菟絲子含藥血清）。TNF-α以預實驗確定的10 ng/ml加入，含藥血清以預實驗確定的6%菟絲子含藥血清加入，將細胞移入超凈操作臺，傾去舊的培養(yǎng)液，每瓶按組分別加入5 ml的條件培養(yǎng)液，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細胞。

2.3 蛋白質印跡法檢測Bcl-2及Bax蛋白表達變化 細胞總蛋白樣品提取，培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，加入細胞裂解液作用1 min后用13 000 r/min離心15 min，吸取上清即細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，記錄D595值，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度，調整蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸5 min冷卻后上樣，各組以GAPDH條帶作為參照，取50 μg細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，通過半干轉印轉移至0.22 μm的PVDF膜，恒壓23 V轉膜45 min；PVDF膜經(jīng)過封閉液封閉2 h后，加入多克隆抗體GAPDH以1∶1 000稀釋，兔多克隆抗體Bcl-2及Bax以1∶300稀釋，4℃孵育過夜，用TPBS漂洗膜2次，每次 10 min，PBS漂洗膜 1次 10 min。加入 1∶5 000 5%牛奶稀釋的HRP標記的羊抗兔抗體作用液（1∶30 000稀釋），于室溫搖床上封閉1 h。用TPBS漂洗膜2次，每次5 min，PBS漂洗膜1次5 min。ECL化學發(fā)光，顯影，定影，拍照；經(jīng)Image Lab分析軟件分析圖像，統(tǒng)計分析比較各組Bcl-2、Bax蛋白與內參GAPDH的比值，進行統(tǒng)計學分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表達，采用F檢驗分析處理各組間的差異，兩兩比較用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 蛻膜細胞的形態(tài)學觀察及鑒定 本實驗采用全組份蛻膜細胞的培養(yǎng)方式，接種后0.5 h即開始貼壁生長，呈較長的梭形狀和不規(guī)則星形；HE染色核呈卵圓形，位于細胞中央，核仁清晰，有豐富的胞漿顆粒。免疫組化染色見胞漿內細小棕色顆粒，越近細胞核，染色越強，陽性細胞計數(shù)結果顯示95%的細胞PRL染色陽性，且細胞大小形態(tài)均一，說明本實驗所用細胞為高純度的蛻膜細胞。見圖1。

圖1 原代培養(yǎng)分離純化蛻膜細胞

3.2 各組蛻膜細胞凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達的變化 經(jīng)蛋白印跡法檢測模型組、治療組和對照組人蛻膜細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達，硝酸纖維素膜電泳、顯影后，出現(xiàn)了清晰的條帶，見圖2。經(jīng)Image Lab分析軟件分析圖像，統(tǒng)計分析比較各組Bcl-2、Bax蛋白與內參GAPDH的比值，結果見表1。顯示模型組的蛻膜細胞Bcl-2蛋白表達明顯低于對照組（P<0.05），而Bax蛋白明顯高于對照組（P<0.05）。與模型組比較，治療組Bcl-2蛋白表達明顯升高，Bax蛋白明顯下降，均有顯著性差異（P<0.05）。

圖2 蛋白質印跡法檢測Bcl-2、Bax蛋白在各組中的表達

表1 蛻膜細胞凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達水平（±s）

表1 蛻膜細胞凋亡調控蛋白Bcl-2、Bax蛋白表達水平（±s）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別 Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH Bcl-2/Bax對照組 0.58±0.10 0.64±0.05 0.90±0.07模型組 0.23±0.04① 1.14±0.11① 0.20±0.06①治療組 0.41±0.09② 0.77±0.10② 0.54±0.16②

4 討 論

妊娠是一個非常復雜而又協(xié)調的過程。胚泡植入后，子宮內膜在雌孕激素及溶解產(chǎn)物等作用下轉化成蛻膜，它與子面滋養(yǎng)層共同構成了母胎界面，對妊娠的建立和維持至關重要。研究表明［4］，人早孕期蛻膜需要一定程度的退化，為滋養(yǎng)細胞的侵入提供空間，而這種退化就是以凋亡的形式發(fā)生的，但蛻膜細胞的凋亡有一定的時空限制，若凋亡細胞增加或發(fā)生異常凋亡，就可能會影響妊娠的繼續(xù)。TNF-α是一種重要的炎癥和免疫調節(jié)因子，早孕孕婦蛻膜組織中的TNF-α主要由激活的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，體內適量的TNF-α對胚胎的生長發(fā)育可能是必需的，而病理狀態(tài)下異常大量產(chǎn)生的TNF-α則會促使蛻膜細胞的過度凋亡及死亡，影響滋養(yǎng)細胞的侵入及胎盤的形成，影響胚胎發(fā)育［5］。Cinar O等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠蛻膜相比，復發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜細胞凋亡明顯增多，這提示大量凋亡的蛻膜細胞可能會導致一系列的細胞功能障礙，影響妊娠的維持。

細胞凋亡的發(fā)生機制與促/抑凋亡基因Bax和Bcl-2的表達密切相關。Bcl-2是一種凋亡抑制蛋白，主要通過線粒體途徑影響細胞凋亡，而Bax主要通過拮抗或抑制Bcl-2的生物學活性來促進凋亡。正常妊娠早、中、晚期胎盤合體滋養(yǎng)層中均表達Bcl-2，妊娠晚期Bc1-2表達明顯高于妊娠早、中期，Bc1-2在合體滋養(yǎng)層中的高表達可能對這些細胞有保護作用，使其不發(fā)生細胞凋亡，有利于滋養(yǎng)層存活［7］。Bcl-2/Bax途徑可能是誘導早孕期蛻膜細胞凋亡的重要因素。Agata K B等［8］通過比較正常妊娠和胎兒生長受限（FGR）過程中Bax和Bcl-2在滋養(yǎng)層和蛻膜層的表達，發(fā)現(xiàn)了促凋亡蛋白Bax在胎盤表達增加，這可能是FGR發(fā)生的原因之一。

菟絲子為傳統(tǒng)的補腎安胎藥，其安胎功效已被長期的臨床實踐所證實。菟絲子黃酮為其主要成分，具有雌激素樣活性及抗氧化、清除自由基等多種生物活性。有研究表明［9］菟絲子黃酮可以增加雌激素受體（ER）及促黃體激素受體（LHR）的表達。給予大鼠菟絲子提取物200 mg/kg灌胃，可以使摘除卵巢模型的大鼠小腦皮層及小腦深層核團中Bax蛋白的表達下調，Bcl-2蛋白的表達上調。在本實驗研究中，TNF-α可以使體外培養(yǎng)的蛻膜細胞中Bcl-2蛋白的表達減弱，Bax蛋白的表達增強，而采用菟絲子含藥血清干預后，可明顯使TNF-α誘導的蛻膜細胞中Bcl-2蛋白表達增強，Bax蛋白表達減弱。因此，我們初步認為菟絲子可能通過降低病理狀態(tài)下蛻膜細胞Bax水平，增高Bcl-2水平，從而抑制早期蛻膜細胞的異常凋亡而起到保胎作用。

［1］李雪蓮，杜平，向亞莉，等.TNF-α在早期自然流產(chǎn)患者血清及蛻膜中的表達［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19（5）：55-56.

［2］劉小麗，秦明春，于愛敏，等.人蛻膜細胞體外培養(yǎng)體系的建立［J］.實用預防醫(yī)學，2007，14（5）：1335-1336.

［3］秦明春，王若光，李春梅，等.TNF-α誘導蛻膜細胞凋亡模型的建立及黃芩苷對蛻膜細胞凋亡影響的初步研究［J］.中國生物工程與臨床康復，2007，11（19）：3793-3795.

［4］李澤蓮，程玲慧，向卉芬，等.凋亡基因與早期妊娠結局的關系［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2013，29（6）：516-518.

［5］Wu Z M，Yang H，Li M，et al.Pro-inflammatory cytokinestimulated first trimester decidual cells enhance macrophage-induced apoptosis of extravillous trophoblasts［J］.Placenta，2012，33（3）：88-94.

［6］Cinar O，Kara F，Can A.Potential role of decidual apoptosis in the pathogenesis of miscarriages［J］.Gynecol Endocrinol，2012，28（5）：382-385.

［7］Soni S，Rath G，Prasad C P，et al.Apoptosis and Bcl-2 protein expression in human placenta over the course of normal pregnancy［J］.Anat Histol Embryol，2010，39：426-431.

［8］Agata K B，Anita S，Urszula K K，et al.Expression of caspase-3，Bax nad Bcl-2 in placentas from pregnancies complicated by treated and non-treated fetal growth restriction［J］.Ginekol Pol，2009，80（9）：652-656.

［9］阿依木古麗，蔡勇，范光麗.雌激素和菟絲子提取物對小腦中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響［J］.西北民族大學學報，2008，29（4）：53-58.