復(fù)方四參顆粒提取和精制工藝優(yōu)化

司愛永， 田 豐， 趙繼會(huì)， 樸香花， 張永太， 馮年平*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203；2.上海市第一人民醫(yī)院分院，上海200081）

復(fù)方四參顆粒提取和精制工藝優(yōu)化

司愛永1， 田 豐2*， 趙繼會(huì)1， 樸香花1， 張永太1， 馮年平1*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203；2.上海市第一人民醫(yī)院分院，上海200081）

目的對(duì)復(fù)方四參顆粒原藥材的提取和精制工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法建立太子參中環(huán)肽B定量測(cè)定的HPLC方法。采用正交設(shè)計(jì)，以太子參環(huán)肽B的提取率為指標(biāo)，對(duì)提取過程中的提取次數(shù)和時(shí)間，以及醇沉過程中的乙醇用量和體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察。結(jié)果方差分析發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)對(duì)太子參環(huán)肽B提取率的影響存在顯著性差異 （P＜0.05），其提取率隨提取次數(shù)的增加而上升。最佳提取和精制工藝為加12倍量水提取3次，每次1.5 h，提取液濃縮后加1.5倍量70%乙醇進(jìn)行醇沉。按最佳工藝進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果太子參環(huán)肽B的提取率均在60%左右。結(jié)論優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定性良好，采用其對(duì)復(fù)方四參顆粒原藥材進(jìn)行提取和精制時(shí)，主要有效成分太子參環(huán)肽B的提取率較高。

復(fù)方四參顆粒；太子參環(huán)肽B；提取率；正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

復(fù)方四參顆粒源于 “國醫(yī)大師”張鏡人教授的經(jīng)驗(yàn)方——復(fù)方四參飲，作為院內(nèi)制劑已有近20年的臨床應(yīng)用，前期臨床調(diào)查了480多例心律失常患者，發(fā)現(xiàn)服用該藥后總有效率達(dá)80%以上。其全方由太子參、南沙參、丹參、苦參、甘草、廣郁金、遠(yuǎn)志 （制）、酸棗仁、蓮子心九味藥組成，其中太子參、南沙參為君藥；丹參、苦參、甘草、廣郁金為臣藥；遠(yuǎn)志 （制）、蓮子心、酸棗仁共為佐使藥。復(fù)方四參顆粒益氣養(yǎng)陰，扶正以治本；活血清熱，祛邪以治標(biāo)，具有益心氣、滋心陰、和心血、寧心神之功效，主治冠心病、病毒性心肌炎等各種心臟病所引起的心律失常、臨床胸悶、心悸乏力、氣短等癥狀，而且對(duì)過早搏動(dòng)，如房性早搏、室性早搏等臨床療效較好［1-3］。

為了進(jìn)一步提高復(fù)方四參顆粒的質(zhì)量，為其新藥申報(bào)奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)在遵循原有提取方法的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［4-7］，選擇君藥太子參中代表性的有效成分太子參環(huán)肽B的提取率為指標(biāo)，對(duì)復(fù)方四參顆粒原藥材的提取和精制工藝作進(jìn)一步優(yōu)化［8-12］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）；BAS224S型微量電子分析天平（德國Sartorius公司）；Minispin高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；SENCOR206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海申生科技有限公司）；JA31002電子天平 （上海精天電子儀器有限公司）。

1.2 試藥 太子參 （批號(hào)140307-1，產(chǎn)地安徽）、南沙參（批號(hào)140218-1，產(chǎn)地吉林）、丹參 （批號(hào)140312-1，產(chǎn)地山東）、甘草 （批號(hào) 130806，產(chǎn)地甘肅）、苦參 （批號(hào)140209-1，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）、廣郁金 （批號(hào)140220-1，產(chǎn)地廣西）、遠(yuǎn)志 （制） （批號(hào)130702-1，產(chǎn)地山東）、酸棗仁（批號(hào)140217-1，產(chǎn)地山東）、蓮子心 （批號(hào)140117-1，產(chǎn)地湖南）（上海萬仕誠國藥制品有限公司）；太子參環(huán)肽B對(duì)照品 （中國科學(xué)院云南昆明植物研究所譚寧華課題組，純度99%以上）。

色譜級(jí)甲醇、乙腈 （德國 Merck公司，批號(hào)P1083040、P1095114）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水 （自制）；分析級(jí)無水乙醇、95%乙醇 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 復(fù)方四參顆粒原藥材提取物中太子參環(huán)肽B測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件 Spursil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，Dikma）；檢測(cè)波長為203 nm；檢測(cè)器為Agilent1260紫外檢測(cè)器；體積流量為1 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL；流動(dòng)相為乙腈和水；洗脫梯度為0～30 min，流動(dòng)相中乙腈比例從5%上升至50%，之后保持恒定。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密吸取太子參環(huán)肽B對(duì)照品10.02mg，置于10 mL棕色量瓶中，甲醇定容，即得對(duì)照品貯備溶液。精密吸取對(duì)照品貯備液2.0 mL，置于50 mL棕色量瓶中，甲醇定容，即得對(duì)照品工作溶液。精密吸取對(duì)照品工作溶液0.6、1.2、2.5、5.0、7.5和10 mL，分別置于10mL量瓶中，甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為2.4～40.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方四參顆粒提取物適量，研細(xì)后精密稱取10.01 g，置于圓底燒瓶中，加甲醇100 mL，水浴回流1 h，過濾后濾液減壓蒸干。殘?jiān)?0 mL無水乙醇溶解，過濾后濾液減壓蒸干，殘?jiān)偌尤?0 mL乙腈溶解，過濾后濾液減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0 mL量瓶中搖勻，即得供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方量藥材 （太子參除外），分別加12倍量水提取3次，每次1.5 h，提取液過濾后合并，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.20（80～85℃），再加入1.5倍量70%乙醇進(jìn)行醇沉，靜置40～48 h，過濾后取上清液，置于圓底燒瓶中，減壓蒸干，殘?jiān)?0 mL無水乙醇溶解，過濾后濾液減壓蒸干，殘?jiān)偌尤?0 mL乙腈溶解，過濾后濾液減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?0 mL量瓶中搖勻，即得陰性對(duì)照溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性 精密取太子參環(huán)肽B標(biāo)準(zhǔn)溶液 （20 μg/mL）、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各20μL，HPLC進(jìn)行分析，所得圖譜見圖1。由圖可知，陰性對(duì)照溶液對(duì)太子參環(huán)肽B的測(cè)定沒有干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察典型圖譜

2.2.2 線性關(guān)系 精密吸取太子參環(huán)肽B標(biāo)準(zhǔn)溶液各20μL，HPLC進(jìn)行分析，以色譜峰面積 （Y）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度 （X）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程Y= 70.522X+13.964，相關(guān)系數(shù) （r）為0.999 9，提示在2.4～40.0μg/mL范圍內(nèi)，太子參環(huán)肽B的質(zhì)量濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3 重復(fù)性和供試品溶液穩(wěn)定性 精密稱取復(fù)方四參顆粒提取物適量，用于制備供試品溶液，在室溫下于48 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣分析。分別記錄連續(xù)測(cè)定5次及0、2、4、8、12、24、36和48 h的色譜峰面積，以所得太子參環(huán)肽B色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD，%）為指標(biāo)，考察方法的重復(fù)性和供試品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果測(cè)得RSD分別為1.16%和1.65%，見表1。由表可知，儀器精密度和方法重復(fù)性良好，而且供試品溶液在室溫下保存48 h時(shí)穩(wěn)定性理想。

2.2.4 加樣回收率 精密稱取復(fù)方四參顆粒提取物適量，平行3份，按照 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)行分析，用于測(cè)定供試品溶液中太子參環(huán)肽B的含有量。然后，再精密稱取太子參環(huán)肽B對(duì)照品12.50 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，即得質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL的對(duì)照品溶液。

表1 供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果

精密稱取復(fù)方四參顆粒提取物適量，平行6份，每份精密加入太子參環(huán)肽B對(duì)照品溶液1.0mL，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備加樣回收率樣品溶液，HPLC進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率樣品和供試品溶液中太子參環(huán)肽B含有量的差異，用于考察加樣回收率，結(jié)果見表2。由表可知，太子參環(huán)肽B的加樣回收率為 （98.45±1.76）%，符合規(guī)定。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 復(fù)方四參顆粒的提取和精制工藝優(yōu)化

2.3.1 實(shí)驗(yàn)方法 采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以太子參環(huán)肽B的提取率為指標(biāo)，對(duì)提取過程中的提取次數(shù)和時(shí)間，以及醇沉過程中的乙醇用量和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察，因素水平見表3。

表3 復(fù)方四參顆粒提取精制工藝優(yōu)化因素水平

2.3.2 結(jié)果和分析 實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。由表可知，各因素對(duì)太子參環(huán)肽B提取率的影響程度為提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞乙醇用量。其中，提取次數(shù)對(duì)太子參環(huán)肽B提取率的影響具有顯著性差異 （P＜0.05），而其他因素?zé)o顯著性差異 （P＞0.05）。因此，確定最佳提取和精制工藝為加12倍量水提取3次，每次1.5 h，提取液濃縮后加1.5倍量70%乙醇（V/V）進(jìn)行醇沉。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別稱取處方量藥材，平行3份，按照優(yōu)化后的工藝進(jìn)行提取和精制，按照 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)行分析，以太子參環(huán)肽B的提取率為指標(biāo)，對(duì)優(yōu)化后的工藝進(jìn)行考察，結(jié)果見表6。由表可知，3次實(shí)驗(yàn)中太子參環(huán)肽B的提取率均在60%左右，表明優(yōu)化后的提取和精制工藝穩(wěn)定性理想。

表4 復(fù)方四參提顆粒取精制工藝優(yōu)化結(jié)果直觀分析

表5 復(fù)方四參顆粒提取精制工藝優(yōu)化結(jié)果方差分析

表6 提取和精制工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

復(fù)方四參顆粒由九味中藥組成，成分比較復(fù)雜，并且太子參環(huán)肽B屬于小分子環(huán)肽，紫外吸收較弱，屬于末端吸收，各種雜質(zhì)信號(hào)的響應(yīng)被進(jìn)一步放大，因而它是方法專屬性考察驗(yàn)證時(shí)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在供試品和陰性對(duì)照品處理過程中，通過應(yīng)用極性不同的無水乙醇和乙腈來純化樣品，除去部分雜質(zhì)，從而降低雜質(zhì)對(duì)太子參環(huán)肽B測(cè)定的影響。另外，在色譜條件考察過程中，本實(shí)驗(yàn)以分離度為主要考察指標(biāo)，通過對(duì)柱溫、流動(dòng)相、梯度洗脫條件、檢測(cè)波長、溶劑等條件的篩選和優(yōu)化，確保了該方法良好的專屬性。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）07-1592-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.046

2014-09-15

上海市科委生物醫(yī)藥領(lǐng)域科技支撐項(xiàng)目 （12401900503）

司愛永（1987—），男，碩士，研究方向?yàn)橹兴巹?chuàng)新制劑。Tel：（021）51323073，E-mail：aiyongsitan@163.com

*通信作者：馮年平 （1967—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴巹?chuàng)新制劑。Tel：（021）51322198，E-mail：npfeng@ hotmail.com田 豐，男，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幮滤幣R床前研究和藥物代謝基礎(chǔ)。Tel：（021）56663031，E-mail：giantison @163.com