玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的分離純化工藝

李祚丹， 季金茍， 楚莎莎， 何 慧， 穆小靜， 徐 溢

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶400044）

玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的分離純化工藝

李祚丹， 季金茍*， 楚莎莎， 何 慧， 穆小靜， 徐 溢

（重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥學(xué)系，重慶400044）

目的提高玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的分離純化效果。方法以哈巴俄苷的吸附率和解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選樹脂，優(yōu)化吸附和解吸條件，并重點(diǎn)考察了pH對(duì)其的影響。結(jié)果HPD100型大孔吸附樹脂能較好地分離純化玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)。在樣品溶液pH 4，吸附時(shí)間48 h條件下，對(duì)哈巴俄苷吸附率可達(dá)95.58%；在洗脫劑為80%乙醇，pH 8，6 BV條件下，對(duì)其解吸率可達(dá)95.35%。結(jié)論HPD100型大孔吸附樹脂對(duì)玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)有較好的分離純化作用，并且適當(dāng)調(diào)節(jié)樣品和洗脫液的pH可進(jìn)一步提高其效果。

玄參；環(huán)烯醚萜；哈巴俄苷；大孔吸附樹脂；分離純化

環(huán)烯醚萜是我國(guó)傳統(tǒng)中藥玄參中的一類化學(xué)物質(zhì)［1-2］，具有多種藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗細(xì)胞染色體誘變、促進(jìn)胰腺分泌、增強(qiáng)免疫作用，并且還對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)有影響［3-4］。按結(jié)構(gòu)分類，玄參中的環(huán)烯醚萜可分為取代環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜苷和環(huán)戊烷開裂的裂環(huán)式環(huán)烯醚萜苷，代表性物質(zhì)為哈巴苷、哈巴俄苷［1，5］。目前，常用硅膠柱層析法分離純化該類成分時(shí)存在成本高、再生處理不方便等缺點(diǎn)，而大孔吸附樹脂具有比表面積大、吸附容量高、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便、使用周期長(zhǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，因而是目前的研究熱點(diǎn)［6-7］。本實(shí)驗(yàn)用大孔吸附樹脂對(duì)玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的分離純化進(jìn)行了研究，除了考察常規(guī)的吸附時(shí)間、洗脫劑濃度等因素對(duì)吸附率和解吸率的影響［8-10］外，還重點(diǎn)關(guān)注了pH對(duì)其的影響，以期得出更好的分離純化工藝。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器設(shè)備 T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；THZ-C恒溫震蕩箱 （江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；KQ-2200B超聲波清洗器 （鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海嘉鵬科技有限公司）；Phs-3C型精密pH計(jì) （上海雷磁儀器廠）。

1.2 材料與試劑 哈巴俄苷對(duì)照品 （純度＞98%，西安朗鴻生物科技有限公司）；玄參 （重慶中藥材公司）；NKAII、AB-8、D101大孔吸附樹脂 （南開大學(xué)化工廠）；HPD100、HPD450大孔吸附樹脂 （滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、鹽酸（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；氫氧化鈉 （分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 稱取玄參干燥根部50 g，切塊，5倍量水浸泡24 h，70℃下加熱回流3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，加適量水溶解，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次［2］。之后將正丁醇部分減壓濃縮，再加水溶解，定容至1 000mL，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 鑒于哈巴俄苷為玄參中環(huán)烯醚萜類成分的代表性物質(zhì)［5］，且 《中國(guó)藥典》在鑒別玄參藥材時(shí)也以其為參考標(biāo)準(zhǔn)［11］，故本實(shí)驗(yàn)以哈巴俄苷為玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的指標(biāo)。

精密稱取哈巴俄苷對(duì)照品0.027 2 g，30%甲醇溶解，定容至50 mL，精密吸取其中2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 m L，分別置于1～5號(hào)10 mL量瓶中，30%甲醇定容。以30%甲醇溶液為參比，在190～600 nm范圍內(nèi)光譜掃描，在最大吸收波長(zhǎng)處以質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度 （Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。

2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 在樹脂柱內(nèi)加入高于樹脂層10 cm的乙醇，浸泡24 h后放出浸液，蒸餾水反復(fù)洗滌至洗滌液加水稀釋不渾濁，并且紫外光譜掃描時(shí)無(wú)吸收峰出現(xiàn)為止。

2.4 大孔吸附樹脂的選擇 精密稱取AB-8、D101、HPD100、HPD450、NKA-II5種樹脂各5.00 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入樣品溶液50.00 mL，30℃下振搖吸附48 h，測(cè)定溶液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率。再將吸附后的樹脂過(guò)濾，60%乙醇50.00 mL振蕩解吸24 h，測(cè)定解吸液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率，以篩選出最適宜分離純化玄參中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的樹脂。吸附率和解吸率按公式 （1）和 （2）計(jì)算。

注：ρ0為吸附前溶液質(zhì)量濃度 （mg/m L）；ρ1為吸附后溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）；ρ2為解吸液質(zhì)量濃度（mg/m L）；V1為樣品溶液體積 （mL）；V2為解吸液體積 （mL）。

2.5 分離純化條件的研究

2.5.1 樣品溶液pH對(duì)吸附率的影響 取8份樣品溶液各50 mL，以0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH將其pH分別調(diào)為3、4、5、6、7、8、9、10，置于8個(gè)裝有5.00 g經(jīng)預(yù)處理的樹脂的錐形瓶中，30℃下振蕩吸附48 h，測(cè)定溶液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率。

2.5.2 靜態(tài)吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響 取經(jīng)預(yù)處理的樹脂5.00 g，置于錐形瓶中，精密加入200.00 mL“2.5.1”項(xiàng)的樣品溶液，30℃下每隔4 h取樣一次，測(cè)定溶液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算吸附率。之后將吸附飽和的大孔樹脂懸浮液離心，除去殘液及樹脂表面水分，留待備用。

2.5.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響 向錐形瓶中加入已達(dá)到吸附平衡的樹脂5.00 g，再分別加入50.00 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，30℃下振蕩解吸24 h，收集各乙醇體積分?jǐn)?shù)下的洗脫液，分別測(cè)定各洗脫液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。

2.5.4 洗脫劑pH對(duì)解吸率的影響 向錐形瓶中加入已達(dá)到吸附平衡樹脂的5.00 g，再分別加入pH分別為5、6、7、8、9、10的洗脫劑50.00 mL，30℃下振蕩解吸24 h，收集各pH下的洗脫液，分別測(cè)定各洗脫液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。

2.5.5 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響 取已達(dá)到吸附平衡的樹脂5.00 g裝柱，2.0 mL/min體積流量下用“2.5.4”項(xiàng)的洗脫劑洗脫，每10.00 mL為1份收集，分別測(cè)定每份洗脫液中哈巴俄苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算解吸率。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過(guò)光譜掃描，確定哈巴俄苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度 （Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.455 9X+0.060 8，r2=0.999 3，表明哈巴俄苷在0.108 8～0.544 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)玄參中環(huán)烯醚萜分離效果的影響 表1為不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)哈巴俄苷分離效果的影響。表1所示，5種樹脂的吸附和解吸性能有所差異，其中HPD100型大孔吸附樹脂對(duì)哈巴俄苷吸附和解吸效果最好，吸附率能達(dá)到95.56%，而解吸率能達(dá)到86.21%。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇HPD100型大孔吸附樹脂用于分離純化玄參中的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)。

表1 大孔吸附樹脂的篩選（n=3）

3.3 樣品溶液pH對(duì)吸附率的影響 圖1為樣品溶液pH對(duì)吸附率的影響，由圖可見，該影響較大。pH＜4時(shí)，樹脂對(duì)哈巴俄苷的吸附率隨pH的增加而上升；pH4時(shí)，吸附率達(dá)到最大；pH＞4時(shí)，吸附率會(huì)顯著下降。推測(cè)可能是由于HPD-100大孔吸附樹脂是苯乙烯型非極性共聚體，因而對(duì)非極性物質(zhì)作用力較強(qiáng)的緣故。哈巴俄苷等環(huán)烯醚萜類化合物是一類含有較多羥基的弱酸性物質(zhì)，在pH4時(shí)，以分子狀態(tài)存在居多，故與HPD-100大孔吸附樹脂作用力較強(qiáng)；酸性增強(qiáng)時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生較多的羥基質(zhì)子化物質(zhì)，因而與該型號(hào)樹脂作用力減弱；堿性增加時(shí)，以共軛堿負(fù)離子形式存在，因而與該型號(hào)樹脂作用力減弱。

圖1 樣品溶液pH對(duì)吸附率的影響

3.4 吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響 圖2為吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響，由圖可見，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，樹脂對(duì)哈巴俄苷的吸附率逐漸增大。0～20 h內(nèi)，吸附率增長(zhǎng)較快；20 h后，吸附率增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩；48 h時(shí)，吸附基本達(dá)到平衡狀態(tài)。由此可知，最佳靜態(tài)吸附時(shí)間為48 h。

圖2 吸附時(shí)間對(duì)吸附率的影響

3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響 圖3為乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響，由圖可見，該影響較大。乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時(shí)，解吸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而上升，且上升趨勢(shì)較快；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，解吸率上升趨勢(shì)變緩；乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，解吸率最大，達(dá)93.02%；乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大時(shí)，解吸率緩慢降低。推測(cè)可能是由于哈巴俄苷等環(huán)烯醚萜類化合物具有一定極性，因而用極性越接近的溶劑洗脫，其解吸率越高，而且極性相差越大，其解吸率越小。這也從另一方面說(shuō)明，80%左右的乙醇可能與哈巴俄苷極性相當(dāng)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響

3.6 洗脫劑pH對(duì)解吸率的影響 圖4為洗脫劑pH對(duì)解吸率的影響，由圖可見，該影響較大，而且弱酸性物質(zhì)易于被弱堿性介質(zhì)洗脫。pH＜8時(shí)，解吸率隨pH的增大而上升；pH 8時(shí)，解吸率最大，達(dá)94.65%；pH＞8時(shí)，解吸率明顯降低，表明溶液的pH值直接影響弱酸性物質(zhì)的存在形式和極性情況。另外圖4還顯示，80%的乙醇與pH 8時(shí)的哈巴俄苷等環(huán)烯醚萜類化合物的極性更為接近，因而解吸率更大。

圖4 洗脫劑pH對(duì)解吸率的影響

3.7 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響 圖5為洗脫劑用量對(duì)解吸量的影響，由圖可見，用量為0～3 BV時(shí)，解吸率的上升趨勢(shì)較快；用量為6 BV時(shí)，解吸率最大，可達(dá)到95.35%；用量進(jìn)一步增大時(shí)，解吸率上升趨勢(shì)明顯變慢。綜合考慮目標(biāo)產(chǎn)物的解吸率和洗脫劑的經(jīng)濟(jì)成本等因素，本實(shí)驗(yàn)選擇6 BV的洗脫劑用量。

4 討論

圖5 洗脫劑用量對(duì)解吸率的影響

綜合考慮5種大孔吸附樹脂對(duì)哈巴俄苷的吸附和解析性能時(shí)發(fā)現(xiàn)，HPD100樹脂最適宜用于分離純化玄參中的環(huán)烯醚萜，對(duì)哈巴俄苷的吸附率和解吸率可分別達(dá)到95.56%和90.46%。本實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件為：玄參樣品溶液pH為4，最佳靜態(tài)吸附時(shí)間為48 h，在此條件下對(duì)哈巴俄苷的吸附率為95.56%；洗脫劑為6 BV、pH為8的80%乙醇溶液，在此條件下對(duì)哈巴俄苷的解吸率可達(dá)到95.35%。

由此可見，HPD100型大孔吸附樹脂適宜用于分離純化玄參中的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，而且適當(dāng)調(diào)節(jié)樣品和洗脫劑的pH值，對(duì)吸附率和解吸率都有較大的提高。

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10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.049

2014-04-12

重慶市墊江縣“121”醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)科技支持示范工程項(xiàng)目（Cstc2014zktjccxyyBX0025）

李祚丹（1989—），女，碩士，從事天然藥物提取研究。E-mail：danney5199@163.com

*通信作者：季金茍（1962—），男，教授，從事藥物化學(xué)研究。Tel：（023）65102531，E-mail：725_tiger@sina.com